Распашные ворота из профильной трубы в Москве и области, цены

Обшивка:	Металлический профиль
Высота (метр):	1.8 — 3 м
Ширина (метр):	3 — 6 м
Комплектующие:	Alutech, Ролтек
Автоматика:	Alutech, AN Motors, Comunello
Фундамент:	Свайно-винтовой; Монолитный
Столбы:	Металл, Кирпич, Пикс-панель

Производство и установка распашных ворот из профильной трубы – это весьма длительный и трудоемкий процесс.

Идеально справиться со всеми поставленными задачами под силу только специально подготовленному человеку. Без наличия соответствующего опыта и комплекса необходимых инструментов реализация работы может усложниться и очень затянуться.

Предлагаем не рисковать и заказать выполнение всего комплекса работ в компании «Группа мастеров». Специалисты организации осуществят все задания профессионально и быстро. Мы предоставляем услуги «под ключ» в Москве и по области, поэтому вам не придется дополнительно искать людей, чтобы осуществить установку конструкций.

Выполняются изделия, как по типовым, так и по оригинальным чертежам. Цвет отделки, размеры и декоративные особенности готовой конструкции зависят исключительно от предпочтений заказчика. Обратившись в компанию «Группу мастеров», вы сможете получить лучший результат за максимально короткий промежуток времени.

Этапы выполнения работ

Изготовление распашных ворот из профильной трубы осуществляется в следующей последовательности:

• замеры для будущей конструкции;
• подготовка чертежа;
• реализация работы по предварительно составленному заданию;
• сборка и установка конструкции.

В случае с распашными воротами требуется сварить две одинаковые створки. Это простая конструкция, поэтому мастера справятся максимально быстро.

Для создания опор применяются большие профильные трубы, их длина превышает 2,5 метра. Одна треть всего основания помещается в землю и в обязательном порядке бетонируется. Данный подход к фиксации вертикальных опор позволяет достигнуть максимальной прочности, надежности и долговечности.

Ширина распашных ворот всегда превышает 3 метра, а высота – 1,6 метров. При конструировании распашных ворот требуется четко соблюдать симметрию всех элементов. От этого во многом зависит долговечность и прочность конструкции. Специалисты компании «Группа мастеров» готовы выполнить весь комплекс работ в соответствии со всеми стандартами и нормами. В результате вы получите эффективный результат с гарантией сроком на 5 лет.

Популярные цвета ворот из профильной трубы

Хотите купить ворота,
но затрудняетесь с выбором?

Оставьте заявку на бесплатную консультацию специалиста. Мы подготовим для вас лучшее предложение и изготовим ворота по выгодной цене

+7 (495) 532-44-20

Особенности материалов и инструментов

При изготовлении распашных ворот могут применяться овальные, круглые, квадратные или прямоугольные профильные трубы. Они изготавливаются из оцинкованной, углеродистой или нержавеющей стали. Используются горячекатаные, холоднокатаные, бесшовные и сварные трубы. Выбор зависит от предпочтений заказчика, условий эксплуатации и конструктивных особенностей.

Почему стоит заказать у нас

Адекватные цены от производителя

Постгарантийное обслуживание распашных ворот

Бесплатный выезд инженера до 30 км от МКАД

Прозрачный договор и смета без скрытых платежей

Организуем вывоз мусора по завершении всех работ

Монтаж распашных ворот за 1 день

Преимущества распашных ворот

Распашные ворота из профильной трубы имеют ряд преимуществ:

• демократичная цена готовой конструкции;
• высокая скорость монтажа;
• доступность материалов для изготовления;
• неприхотливость в обслуживании;
• возможность установки автоматики;
• долговечность и надежность;
• широкий выбор вариантов дизайнерского оформления.

При выборе данного варианта сооружения ворот отсутствует необходимость создания бетонной площадки под ролики. Эта особенность также позволяет значительно сократить время на реализацию всех заданий.

Схема сотрудничества

Свяжитесь с нами

Ежедневно с 8:00 до 20:00 вы можете оставить заявку или позвонить нам

Выезд замерщика

Специалист-замерщик бесплатно приедет в удобное для вас время

Расчет

Окончательный расчет стоимости

Заключение договора

На месте или в нашем офисе

Изготовление

Все изделия изготавливаются на нашем современном производстве

Доставка и монтаж

Установка изделий и оборудования профессионалами-монтажниками

Закажите распашные ворота из профильной трубы в Москве в компании «Группа мастеров» — оцените наши высокие стандарты обслуживания.

Популярные размеры

виды и изготовление своими руками

Если вы решили установить на своем участке ворота, то перед вами может стать вопрос, какой тип конструкции установить проще и экономичней.

Доступность материалов, простота изготовления и установки, транспортировки и эксплуатации, это лишь краткий список преимуществ, которыми обладают ворота из профильной трубы. Для изготовления конструкции этого типа не требуется большой список материалов и инструментов, главное это умение работать со сварочным аппаратом и знание особенностей стального материала.

Почему из профиля

Главным преимуществом материала является долговечность, надежность и прочность, а главное цена. Конечно существует и ряд недостатков, но их перекрывает доступность профильных труб на рынке.

Плюсы и минусы

Врата из профильных труб имеют ряд достоинств и недостатков, на которые следует обратить внимание.

Основные плюсы:

• Доступность и стоимость профильных труб на рынке;
• Длительная эксплуатация;
• Простая установка, которую можно произвести своими руками, без привлечения специалистов;
• Надежная конструкция;
• Возможность реализации различных дизайнерских решений, в том числе в отношении забора и калитки;

Но существуют и недостатки ворот из данного материала, к ним можно отнести следующие минусы профильных труб:

1. Подверженность к коррозии – при постоянном контакте и взаимодействии с влажной средой, а также при проникновении жидкостей внутрь труб, существует опасность развития ржавчины;
2. При использовании резьбовых креплений, возможно появление деформации конструкции;
3. Большое количество необходимой краски и грунтовки, а также длительное нанесение защитных материалов.

Виды ворот

Ворота из профтрубы подразделяются на разновидности по способам открывания: раздвижные, откатные или распашные. Каждый из этих трех вариантов можно выполнить в уникальном и красивом дизайне, главное это заранее подготовить правильные чертежи для успешного монтажа и удобной эксплуатации в будущем.

Распашные

Самая легкая в установке конструкция, для её монтажа необходима только сварка и болгарка. Такие ворота устанавливаются как к забору, так и на гараж, очень легко, на обычные петли.

Раздвижные

Этот тип часто используется если решено из профиля сконструировать гаражные ворота.

Их можно установить и к обычному забору. Их так же устанавливают на роликах, они сложны в реализации, но при этом имеют большую популярность.

Откатные

Если у вас нет желания возиться с петлями или вы хотите сделать удобную для эксплуатации конструкцию, то можно установить откатное решение на роликах – это более сложно в реализации, но выглядит эффектно и удобнее чем обычные распашные ворота.

Подготовка

Перед тем как начать изготовление ворот из профильной трубы своими руками, нужно провести ряд подготовительных работ, которые позволят изготовить каркас соответствующим образом.

Для начала проведите замеры, затем приступите к составлению чертежей и только после этого приступайте к приобретению материала и монтажу.

Как рассчитать размеры конструкции

Если вы владелец автомобиля, то важно подобрать ширину, которая позволит эксплуатировать машину с удобством. Стандартной является конструкция размером 4 метра в ширину и 2 метра в высоту. Если вы устанавливаете ворота на заранее установленных опорах, то в расчетах учтите размер петель и зазор между створками, а также заранее подсчитайте расстояние между опорами ворот и калитки, если таковая предполагается.

Когда вы определились с размерами, можно приступать к созданию чертежа.

Чертеж

На чертеже нужно не только указать размеры конструкции, но и определиться с основанием ворот. Обычно профильные трубы закапывают в землю, бетонируя их для устойчивости. Можно использовать готовый чертеж:

Данный чертеж ворот с калиткой, если вы её будете сооружать из другого материала, то её можно не использовать при создании чертежа.

Как выбрать профиль

Профиль применяется в различных строительных сферах, поэтому его ассортимент достаточно широк. Трубы различаются по размеру сечения, покрытию, форме и материалу из которого изготовлены: оцинкованная сталь, нержавеющая, углеродистая. Первый тип металла не подойдет для изготовления ворот – он слишком легкий, а вот углеродистая и нержавеющая сталь отлично подходит.

Стали различных марок имеют разную плотность и могут использоваться в различных климатических регионах.

Так же профиль различается по технологиям производства. Бесшовные выдерживают значительные нагрузки, вибрацию, постоянные удары, но они имеют высокую стоимость. А сварной профиль достаточно дешевый, но он менее устойчив к повреждениям. Выбор профильной трубы для ворот предопределяет срок службы конструкции.

Расчет материала

Именно чертеж позволяет понять нужное количество профильных труб, но кроме их понадобятся и другие необходимые материалы:

1. Петли или ролики – в зависимости от выбранного типа решения;
2. Обшивочный материал и элементы декоры, если таковые предусмотрены;
3. Замок или другие элементы фиксации, например, щеколда или защелка;
4. Грунтовка и краска – для защиты конструкции от возможной коррозии.

Количество материалов можно подсчитать при помощи чертежа, который составлен. Если вы решили использовать предложенный выше пример чертежа, то вам понадобится следующее количество материалов:

• Квадратный профиль 80*80 мм длинной 3 метра в количестве 3 штук, для возведения основания.
• Профильная труба размером 40*20 для сооружения ворот длиной 3 метра в количестве 10 штук.
• Замок для калитки.
• Металлический засов.
• Петли гаражные 6 штук.
• 1 мешок цемента для фундамента основания.
• Грунтовка и краска по 1 литру.

Количество материалов может быть другим, если вы предполагаете сооружение, отличающееся от чертежа выше.

Необходимые инструменты

Перечень инструментария для сооружения может быть различным, но обычно возникает необходимость в следующих инструментах:

1. Сварочный аппарат и электроды;
2. Измерительные инструменты: уровень, уголок, рулетка;
3. Дрель;
4. Болгарка и диски для резки и шлифовки металла;
5. Кисти для нанесения краски и грунтовки.

Пошаговая инструкция сборка и установка своими руками

Когда подготовлен чертеж и материалы, можно приступать к работам по монтажу ворот. Более подробно разобраться как поэтапно установить ворота своими руками можно ознакомившись с видеороликом в конце статьи.

Для начала определитесь, как вы будете сооружать конструкцию: используя сварку или соединяя профиль резьбовым способом.

Сварка или резьба

Если вы не знаете, как правильно сварить ворота, так как не умеете обращаться со сваркой, то можно собрать конструкцию из профильных труб при помощи обычных болтов и дрели. Это более трудоемкий процесс, но его сможет произвести любой домохозяин. В любом случае лучше использовать сварку – если вы не умеете обращаться с аппаратом, можно нанять квалифицированного сварщика для этой цели.

Резка трубы

Нарезка заготовок производится соответственно чертежу, при помощи болгарки и диска для резки металла. На местах срезов металлопрофиль необходимо зачистить шлифовальной машинкой. Ржавчина удаляется так же.

Установка опор

Заранее определяется местоположение будущих ворот, в местах установки опор выкапываются ямы глубиной не менее одного метра и шириной 10 сантиметров. Высота опорных столбов должна соответствовать составленному чертежу и высоте ворот. Внутрь ям засыпается песок, щебень. Затем столбы устанавливаются внутрь ямок, после чего они заливаются бетоном.

Используйте схему или чертеж, подготовленный заранее для правильного монтажа опорных конструкций.

Используя чертеж выше, можно понять, что опора должна быть закопана и забетонирована в землю на глубину 1 метр.

Петли

Петли для монтажа устанавливаются заранее, на местоположение, предусмотренное на чертежах. Петли легче всего приваривать обычным сварочным аппаратом, но при желании их можно монтировать посредством болтов. Варить петли на ворота лучше всего третьими электродами, чтобы не повредить детали или профиль.

Монтаж каркаса

Когда петли приварены к опорам, можно приступать к сборке ворот. Используя чертеж выше, необходимо правильно сложить конструкцию перед сварочными работами на земле. Каждая створка должна иметь форму прямоугольника, при этом в середине каждой, горизонтально земли устанавливаются планки, для целостности конструкции. Чтобы створки имели правильные углы устанавливается диагональная планка.

Все трубы, используемые в конструкции предложенную нами для установки, имеют размер 2 метра. Таким образом согласно чертежу выше, у вас получится две зеркальные створки, на каждую из которых навариваются петли на расстоянии 15 сантиметров от нижнего и верхнего угла. Они позволят прикрепить каркас к опорным столбам.

Крепление к опорам

Процесс крепления к опорам проводится вручную. Для работ понадобится несколько человек: поднимающие каркас и контролирующие процесс крепления каркаса при помощи петель к опорным столбам.

Калитка

Если вы решили устанавливать калитку так же из профильных труб, то её изготовление, монтаж и крепление производится точно так же. Согласно чертежу, предложенному нами, калитка имеет ту же высоту, но три горизонтальные планки должны иметь меньшую длину – 1.2 метра. Сборка конструкции так же производится на земле, согласно рисунку.

После окончания сборки, навариваются 2 петли на расстоянии 15 сантиметров от верхнего и нижнего углов калитки.

Отделка

После завершения работ по монтажу каркаса, его нужно обезжирить, покрыть грунтовкой для предотвращения коррозии и краской для долговечности. Затем конструкцию просушивают и приступают к отделке. Всего существует несколько способов отделки ворот из профильных труб, самыми популярными являются: ковка, профильный лист, дерево, поликарбонат, металлическая сетка или листы.

Декор ковкой

Очень эффектно смотрится каркас обшитый кованными деталями из арматуры. Для создания красивых кованных ворот понадобится профессиональная помощь сварщика 3 разряда. Декор ковкой выглядит следующим образом:

Сетка

Обшивка профильного каркаса металлической сеткой смотрится не эффектно, но данный способ позволяет значительно сэкономить на отделке. Сетка очень дешевый материал, а крепить его проще других – можно при помощи болтов, а возможно и использование проволоки. Этот вариант подойдет для реализации на дачных участках.

Поликарбонат

Отделка карбонатом сегодня очень популярна, но у неё есть один недостаток – конструкция по сути прозрачна, как и при обшивке каркаса сеткой. Установка поликарбоната на корпуса очень легкая – всё что нужно это сделать отверстия дрелью и закрепить листы поликарбоната на профильных трубах посредством болтов.

Профлист

Более экономичным и простым в монтаже считается установка на каркас профнастила. Всё что нужно при монтаже профлиста – в нужных местах просверлить отверстия и вкрутить в них болты. Выглядят подобные ворота следующим образом:

Обшивка металлом

В середине девяностых очень популярным была отделка профильного каркаса металлическими листами. Их крепеж производится при помощи сварки – на болтах тяжелые листы металла не смогут держаться. Обычно рекомендуют использование холоднокатаных типов стали для этой цели.

Грунтовка и окраска

После окончания работ по монтажу, следует приступить к обработке металлических поверхностей. Тщательно прогрунтуйте в местах соединения профильных элементов с деталями конструкции, чтобы избежать появления ржавчины.

Древесина

Дерево в роли обшивки ограждений и ворот смотрится очень красиво, кроме того спустя некоторое время обшитые древесиной модели смотрятся еще красивее чем в первоначальной версии. Минусом этого вида обшивки является его низкая устойчивость к гниению и механическому воздействию – после монтажа дерева, его нужно тщательно обработать пропитками, грунтовкой и лаком.

После того как отделка закончена, можно приступить к установке замков, грунтовочным и покрасочным работам, а также могут быть установлены элементы декора.

Установка замков

Обычно систему замка устанавливают в опоры, но если ворота закреплены непосредственно на забор, то можно установить защитный замок и на него.

Приобретать лучше надежные модели замков, со сложным ключом, врезного типа. Многие используют классическую щеколду, которую устанавливают с внутренней стороны двора или гаража. Если отделка была произведена металлическими листами, то вся поверхность каждого полотна должна быть тщательна обработана грунтовкой и окрашена в два слоя.

Видео процесса

Как быстро изготовить и установить сварные распашные ворота из профильных труб показано в данном видеоролике:

Откатные ворота «ОПТИМА-П» с заполнением профильным листом

ВНИМАНИЕ! Мы сохраняем лучшие цены на столбы, 2D и 3D панель- «сетка ГИТТЕР» , в наличии на складе панели из прутка 3,0-5,0мм, высота 1,5-2,4м., широкая цветовая гамма. Подробнее>>>   В продаже обрезки 3D сеток шириной L 400-700мм высота 1,5-2м. (дисконт) — 100,00р./шт.

Представляем промышленные откатные ворота серии «ОПТИМА-П». Ворота консольного типа под заполнение профильным листом, металлическим штакетником или поликарбонатом. Представленные модели ориентированы для эксплуатации на промышленных объектах, производственных базах и т. д. Имеют адекватный запас прочности в соответствии со своими габаритными размерим. При необходимости допускается установка дополнительных кронштейнов под установку плоского барьера безопасности или колючей проволоки.  

Приглашаем к сотрудничеству торговые и строительные компании, проектные бюро. Предоставляем необходимую техническую информацию.

Раздел оформляется, информацию по изделиям вы можете получить, направив запрос через форму заказа или позвонив по телефонам указанным на сайте.

КАРКАСЫ ОТКАТНЫХ ВОРОТ СЕРИЯ «ОПТИМА-П» ВЫСОТОЙ 2000мм (2,0м)
	С ЦВЕТНЫМ ПОЛИМЕРНЫМ  ПОКРЫТИЕМ			ОЦИНКОВАННЫЕ, С ЦВЕТНЫМ ПОЛИМЕРНЫМ  ПОКРЫТИЕМ
РАЗМЕР АхВмм.	6000х2000	7000х2000	8000х2000	6000х2000	7000х2000	8000х2000
Комплект ворот (с ручным открытием)	00,00р.	00,00р.	00,00р.	00,00р.	00,00р.	00,00р.
Комплект ворот с подготовкой под автоматику (с установленой зубчатой рейкой)	00,00р.	00,00р.	00,00р.	00,00р.	00,00р.	00,00р.
Комплект ворот с установленной зубчатой рейкой + Автомаический Привод CAME Brown (комплект)*	00,00р.	00,00р.	—	00,00р.	00,00р	—

 

Характеристики
Наименование	Роликовая система	материал каркаса	заполнение	материал столбов	Покрытие
ВОРОТА ОТКАТНЫЕ «ОПТИМА-П»	«ЕВРО»  проем до 7 метров, весом до 800кг. «МАХ» проем до 12 метров, весом до 2000кг.	Труба профильная  60х60х3	Труба профильная 40х20х2, 50х30х2	Труба профильная  100х100, 120х120	РЕ

 

Комплектация
Каркас  ворот с подготовкой под заполнение	Направляющая шина	Оцинкованная регулиовочная площадка	Оцинкованная роликовая опора	П-образные столбы	Комплект фурнитуры для откатных ворот.
1шт.	1шт.	2шт.	2шт.	3шт.	1шт.

 Производитель, оставляет за собой право изменять конструкторские решения по внешнему виду и комплектующим материалам в представленных вариантах ворот. Произведённые изменения не будут оказывать негативное влияние на физические свойства ворот и гарантийный срок эксплуатации.

Приведённая выше информация носит справочный характер и не является публичной офертой. Указанные цены являются индикативными и не гарантируются.
Они призваны служить своеобразной справкой при выборе интересующего товара или услуги. Реальные цены продажи подлежат уточнению у менеджеров отдела продаж.

Статьи о воротах, роллетах, алюминиевых профильных системах для корпоративных клиентов в России

Все Новости Статьи Видео

Все Роллетные системы Промышленные и панорамные ворота Алюминиевые профильные системы Перегрузочное оборудование Шлагбаумы Производство

Статья

29. 12.2020

Промышленные и панорамные ворота

Статья

Секционные ворота «АЛЮТЕХ»: безопасность в любой ситуации

Реальность меняется каждый миг, и нам это нравится. При одном условии: что мы и наши близкие неизменно будем в безопасности. В том числе при эксплуатации секционных ворот. Но может ли их конструкция гарантировать защиту в непредвиденных ситуациях? Например, когда вас срочно вызывают на очень важную встречу, вы быстро прыгаете в машину и, еще находясь под полотном ворот, нажимаете на кнопку пульта, чтобы их закрыть.

Производство

Статья

Секционные ворота «АЛЮТЕХ»: нестандартный заказ в стандартные сроки

Едва выбрав секционные ворота, вы уже представляете, как открываете их одним нажатием на кнопку пульта. И тут выясняется, что проем вашего гаража имеет особые размеры, а выбранный цвет не входит в число стандартных и нужно оформлять спецзаказ. О сроках, стоимости и других нюансах изготовления индивидуальной конструкции рассказал заместитель директора по маркетингу ООО «Алютех Воротные Системы» Андрей БУЛОЙЧИК.

Роллетные системы

Статья

Как тестируется лакокрасочное покрытие рольставен?

Полотно роллетных систем ежедневно подвергается достаточно большой механической нагрузке. Способно ли оно остаться привлекательным в таких жестких условиях? Отвечает Станислав КУЗЬМИЦКИЙ, заместитель директора по маркетингу ООО «Алютех Инкорпорейтед» — ведущего завода по производству роллетных систем на территории СНГ.

Роллетные системы

Статья

Кто сильнее — ветер или роллеты?

В некоторых регионах СНГ скорость ветра достигает 25,2 м/с. Шкала Бофорта характеризует ветер такой силы как сильный шторм, способный вырвать деревья с корнем. Чтобы защитить от него окна и двери, производители предлагают установить роллетные системы. Благодаря чему рольставни справляются со стихией, рассказал заместитель директора по маркетингу ООО «Алютех Инкорпорейтед» Станислав КУЗЬМИЦКИЙ.

Роллетные системы

Статья

Роллета спасет от ветра?

Роллетные системы позиционируются как надежная защита от ветра. Однако, учитывая большую разбежку в силе его порывов в разных регионах, встает вопрос: насколько? О том, как правильно подобрать роллету, не запутавшись в ГОСТах и СНиПах, рассказал заместитель директора по маркетингу ООО «Алютех Инкорпорейтед» Станислав КУЗЬМИЦКИЙ.

Промышленные и панорамные ворота, Перегрузочное оборудование

Статья

Комплексное предложение для Вашего склада

Эффективность работы любого склада напрямую зависит от скорости и безопасности перемещения грузов. Для выполнения столь объемных задач ООО «Алютех Торговый дом» предлагает комплексное решение: промышленные ворота  «АЛЮТЕХ» и перегрузочное оборудование торговой марки Alutech/Novodock, выпускаемое немецкой компанией Novoferm специально для компании «Алютех Торговый дом».

Алюминиевые профильные системы

Статья

Качественная фурнитура: легкость движения

Открыть, закрыть, повернуть, зафиксировать — эти действия совершаются с оконными и дверными створками ежедневно. Командует парадом фурнитура — набор самых миниатюрных деталей конструкции. Именно от ее качества зависит легкость движений окна и двери. Производители, которые заботятся о долговечности и красоте архитектурно-строительных систем, уделяют фурнитуре особое внимание.

Алюминиевые профильные системы

Статья

Фасад в стиле hi-tech стал выгодной реальностью

Чем определяется современность здания? По мнению большинства специалистов, прежде всего, дизайном и долговечностью. Именно поэтому оштукатуренные фасады, которые через год-два теряют свой внешний вид, постепенно отходят в прошлое. Ведь многие замыслы архитекторов осыпаются вместе со штукатуркой. Повреждение фасада, как правило, ведет к внутренним, более серьезным разрушениям. В результате приходится вкладывать дополнительные средства в ремонт здания.

Роллетные системы

Статья

Как распознать некачественные рольставни, или развернутый диалог о зебрах, фольге и ювелирных магазинах

Знаете ли вы, что некоторые рольставни изготавливаются из фольги, а полотно других очень напоминает зебру? Как распознать некачественную роллетную систему до покупки, рассказал Станислав КУЗЬМИЦКИЙ, заместитель директора по маркетингу ООО «Алютех Инкорпорейтед» — ведущего предприятия по производству роллетных систем на территории СНГ.

Шлагбаумы

Статья

Шлагбаум в городе. Зачем нужен и как выбрать?

Автоматические шлагбаумы – неотъемлемый атрибут современного города, эффективный и быстрый способ контролировать число машин, допускаемых на охраняемую территорию. Они также работают на имидж компаний, которые заботятся о безопасности своих сотрудников, административных и производственных площадей.

Шлагбаумы

Статья

Как гарантированно получить место на парковке?

Нехватка парковочных мест на стоянке перед домом — распространенная проблема современных городов. Простой выход из сложной ситуации — установить шлагбаум, который не пропустит чужой транспорт в ваш двор. Современные шлагбаумы отличаются безопасностью, надежностью и простотой управления.

AWS Fargate — Amazon EKS

В этом разделе обсуждается использование Amazon EKS для запуска модулей Kubernetes на AWS Fargate.

AWS Fargate — это технология, которая по требованию предоставляет вычислительные мощности нужного размера для контейнеров. С AWS Fargate вы не должны самостоятельно выделять, настраивать или масштабировать группы виртуальных машин для запуска контейнеры. Вам также не нужно выбирать типы серверов, решайте, когда масштабировать свою ноду. групп или оптимизировать упаковку кластеров. Вы можете контролировать, какие модули запускаются на Fargate и как они работать с профилями Fargate. Профили Fargate определяются как частью вашего кластера Amazon EKS.

Amazon EKS интегрирует Kubernetes с AWS Fargate с помощью контроллеров, созданных AWS. используя восходящую расширяемую модель, предоставляемую Kubernetes. Эти контроллеры работают как часть Amazon EKS управляет плоскостью управления Kubernetes и отвечает за планирование собственных модулей Kubernetes на Fargate. Контроллеры Fargate включают новый планировщик, который работает вместе с планировщик Kubernetes по умолчанию в дополнение к нескольким изменениям и проверке допуска контроллеры. Когда вы запускаете модуль, который соответствует критериям для работы на Fargate, Fargate контроллеры, работающие в кластере, распознают, обновляют и планируют pod на Фаргейт.

В этом разделе описываются различные компоненты модулей, работающих на Fargate, и вызывается особые замечания по использованию Fargate с Amazon EKS.

Вот некоторые моменты, которые следует учитывать при использовании Fargate на Amazon EKS.

• AWS Fargate с Amazon EKS доступен во всех регионах Amazon EKS, кроме AWS GovCloud (Восток США) и AWS GovCloud (Запад США).

• Каждый модуль, работающий на Fargate, имеет собственную границу изоляции. они не делятся базовое ядро, ресурсы ЦП, ресурсы памяти или эластичная сеть интерфейс с другим модулем.

• Балансировщики сетевой нагрузки

  и балансировщики нагрузки приложений (ALB) могут использоваться с Fargate только с IP-целями. Дополнительные сведения см. в разделах Создание балансировщика сетевой нагрузки и Балансировка нагрузки приложений в Amazon EKS.

• Открытые службы Fargate работают только в режиме IP-адреса целевого типа, а не в режиме IP-узла. режим. Рекомендуемый способ проверки подключения из службы, работающей на управляемый узел и служба, работающая на Fargate, должна подключаться через службу имя.

• Поды должны соответствовать профилю Fargate на время, когда они запланированы для запуска. Фаргейт. Модули, не соответствующие профилю Fargate, могут зависнуть как В ожидании . Если существует соответствующий профиль Fargate, вы можете удалить ожидающие контейнеры, которые вы создали, чтобы перенести их на Fargate.

• Наборы демонов не поддерживаются на Fargate. Если вашему приложению требуется демон, перенастройте этот демон для работы в качестве контейнера sidecar в ваших модулях.

• Привилегированные контейнеры не поддерживаются в Fargate.

• Поды, работающие на Fargate, не могут указывать HostPort или HostNetwork в манифесте модуля.

• По умолчанию nofile и мягкое ограничение nproc равно 1024 и жесткое ограничение составляет 65535 для модулей Fargate.

• Графические процессоры

  в настоящее время недоступны на Fargate.

• Модули, работающие на Fargate, поддерживаются только в частных подсетях (со шлюзом NAT). доступ к сервисам AWS, но не прямой маршрут к интернет-шлюзу), поэтому VPC вашего кластера должны иметь доступные частные подсети. Для кластеров без исходящий доступ в Интернет, см. Требования к частному кластеру.

• Вы можете использовать автомасштабирование вертикальных модулей, чтобы установить начальный правильный размер ЦП и памяти для модулей Fargate, а затем используйте автомасштабирование Horizontal Pod для их масштабирования. стручки. Если вы хотите, чтобы автомасштабирование вертикальных модулей автоматически повторно развертывать модули в Fargate с большим процессором и комбинаций памяти, установите режим вертикального автомасштабирования Pod на Авто или Воссоздайте для обеспечения правильной работы. Дополнительные сведения см. в документации по автомасштабированию вертикальных модулей на Гитхаб.

• Для вашего VPC должны быть включены разрешение DNS

  и имена хостов DNS. Для большего информацию см. в разделе Просмотр и обновление поддержки DNS для вашего VPC.

• Amazon EKS Fargate обеспечивает глубокую защиту приложений Kubernetes за счет изоляции каждый Pod внутри виртуальной машины (VM). Эта граница виртуальной машины предотвращает доступ к ресурсы хоста, используемые другими модулями в случае побега контейнера, который является распространенным методом атаки на контейнерные приложения и получения доступа к ресурсам вне контейнера.

  Использование Amazon EKS не меняет ваших обязанностей в соответствии с моделью общей ответственности. Вы должны тщательно рассмотрите настройку средств безопасности и управления кластером. Самый безопасный способ изолировать приложение — всегда запускать его в отдельном кластер.

• Профили

  Fargate поддерживают указание подсетей из вторичных блоков CIDR VPC. Ты может захотеть указать вторичный блок CIDR. Это потому, что есть ограниченный количество доступных IP-адресов в подсети. В результате имеется также ограниченное количество модулей, которые можно создать в кластере. Используя разные подсети для модулей, вы можете увеличить количество доступных IP-адресов. За подробнее см. Добавление IPv4 CIDR блоки в VPC.

• Служба метаданных экземпляра Amazon EC2 (IMDS) недоступна для модулей, которые развернуты на узлах Fargate. Если у вас есть модули, развернутые в Fargate, которым требуется Учетные данные IAM, назначьте их своим модулям, используя роли IAM для учетных записей служб. Если вашим модулям нужен доступ к другой информации, доступной через IMDS, вы должны жестко закодировать эту информацию в вашу спецификацию pod. Сюда входит регион AWS или зона доступности, в которой pod развертывается в.

• Вы не можете развернуть модули Fargate в AWS Outposts, AWS Wavelength или AWS Local Zones.

• Amazon EKS должен периодически исправлять модули AWS Fargate, чтобы обеспечивать их безопасность. Мы попытайтесь установить обновления таким образом, чтобы уменьшить воздействие, но бывают случаи, когда модули должны быть удалены, если они не были успешно выселены. Есть некоторые действия, которые вы может принять, чтобы свести к минимуму нарушения. Дополнительные сведения см. в разделе Исправление модуля Fargate.

• CNI Amazon VPC плагин для Amazon EKS установлен на узлах Fargate. Вы не можете использовать Чередуйте совместимые плагины CNI с узлами Fargate.

Javascript отключен или недоступен в вашем браузере.

Чтобы использовать документацию Amazon Web Services, должен быть включен Javascript. Инструкции см. на страницах справки вашего браузера.

Условные обозначения в документе

Обновление существующей группы узлов

Начало работы с Fargate

Профилировщик памяти .NET By Redgate

Профилировщик памяти .NET By Redgate | ANTS Memory Profiler

Найдите утечки памяти и оптимизируйте использование памяти в вашем приложении .NET

Разработчики .NET используют ANTS Memory Profiler для:

• Поиска утечек памяти в течение нескольких минут
• Оптимизация использования памяти вашим кодом C# и VB.NET
• Профилируйте использование вашим кодом неуправляемой памяти
• Создание более эффективных, меньше ресурсов применения

---

Попробуйте его бесплатно в течение 14 дней

Скачать бесплатно испытать

1 год подписка

$ 396 $ 396 $ 396 на пользователь

Buy

11 1 Года. 336 $ 336 $ 336 за пользователя

Купить сейчас

Годовая подписка

$ 324 $ 324 $ 324 за пользователя

Купить сейчас

20+

Персонализированные пользователи 9

3

03

Зачем использовать ANTS Memory Profiler?

Автоматическое управление памятью в .NET значительно упрощает разработку, но при этом легко допустить утечку памяти в ваше приложение. Например, если вы забудете отменить регистрацию обработчиков событий, это может привести к ненужному удерживанию значительных участков памяти, но заметить, что это происходит, может быть очень сложно.

Попытка понять проблемы с памятью без подходящего инструмента может занять часы или дни, если вам посчастливится узнать о существовании проблемы. Это время лучше потратить на решение проблемы.

---

Инструмент, который должен использовать каждый разработчик .NET

ANTS Memory Profiler упрощает профилирование памяти.

Основные характеристики

Получение четких, содержательных результатов

Упрощение интерпретации информации. Тратьте свое время на решение проблем, вместо того, чтобы пытаться их понять.

Быстрое получение результатов

Имея размер менее 32 МБ, профилировщик может удобно профилировать большие и сложные приложения практически без дополнительных затрат. Делайте столько снимков памяти кучи, сколько хотите, за секунды, а не за минуты.

Быстро визуализируйте взаимосвязи между вашими объектами

Используйте график хранения экземпляров, чтобы быстро увидеть, почему ваши объекты с утечкой все еще удерживаются в памяти. Вам не нужно создавать ментальную карту, чтобы отслеживать, как объекты ссылаются друг на друга.

Прямой путь к источнику проблемы

Интеллектуальный анализ выявляет наиболее вероятные причины проблем, часто экономя часы поиска проблем.

Немедленно остановитесь на причине

Мощные параметры фильтрации позволяют вам избавиться от шума, позволяя быстро добраться до корня даже самых сложных проблем.

---

Если вы программируете на C# или VB. NET и вам нужно понять, куда уходит ваша память, попробуйте ANTS Memory Profiler.

Загрузка, установка и начало использования инструмента занимает пять минут.

«ANTS Memory Profiler — это невероятный, действительно потрясающий продукт. Отличный небольшой инструмент для определения того, какие части вашего кода занимают больше всего времени/ресурсов.

Я потратил бесчисленное количество часов на отладку проблем со сборкой мусора, где я понятия не имел, куда я направляюсь. Этот инструмент показал мне системный подход к отладке веб-приложений и поиску утечек памяти.

Проблема, которую я решал несколько месяцев, была решена за несколько дней. Спасибо, Редгейт!»

Маюреш Савардека

«Мне потребовались бы недели, чтобы найти причину, но через два часа после установки ANTS Memory Profiler проблема была решена; он окупился в первый же день, когда я его использовал».

Грэм Эллиотт, ведущий архитектор, Spirit Software Solutions

«Меня поразил интерфейс и качество информации, которую я смог обнаружить. С тех пор я рекомендовал его многим друзьям.

Это отличная программа, даже по стандартам Redgate!

Джон Галлоуэй, Herding Code

«Я пытался найти утечки памяти в нашем приложении WPF и оценивал инструменты, которые помогут мне в решении этой задачи.

Мне было трудно найти инструмент, который работал достаточно хорошо, пока я не нашел ANTS Memory Profiler. Я скачал инструмент, и он просто работает.

Возможности производительности и анализа намного превосходят любые другие инструменты, на которые я обращал внимание, и я нахожу их очень интуитивно понятными».

Лау Бакман, архитектор программного обеспечения, Gladstone Health & Leisure, Дания

«Я только что проверил этот новый профилировщик памяти, и это чертовски приятно!

У нас есть известная утечка памяти, на обнаружение которой у меня ушло около 4 часов с помощью нашего текущего инструмента, поэтому я запустил вашу новую версию и занялся ею, как будто я не знал об утечке.

Я не только быстрее пришел к выводу, но и нашел еще один!»

Аарон Смит, ИТ-менеджер Р.К. Системы, Инк

• График хранения экземпляров быстро позволяет увидеть кратчайшие пути ссылок ко всем корням GC, которые нужно будет разбить для устранения утечек памяти.
• Сравните любые два снимка друг с другом.
• Автоматизированный API для создания моментальных снимков из вашего приложения с помощью одной строки кода.
• Возможность подключения к запущенному процессу .NET 4 / 4.5 / 4.6. Идеально, если вы хотите свести время простоя к нулю и сохранить состояние вашего текущего процесса.
• Возможность профилирования исполняемых файлов .NET, приложений и веб-служб ASP.NET и ASP.NET 5 DNX в IIS, IIS Express и Web Development Server, рабочих и веб-ролей, работающих в локальном эмуляторе Azure, коллекциях SharePoint 2007 или 2010, Silverlight приложения, службы Windows и приложения COM+.
• Поддерживает от .NET 2 до . NET 4.7, включая .NET Core и .NET Standard, на любом языке, поддерживаемом платформой .NET.

• Использование профиля неуправляемой памяти — если ваш код .NET использует неуправляемый код или компоненты, вы можете увидеть, сколько памяти занимают неуправляемые модули и классы.
• Возможность делать и анализировать произвольно большое количество снимков памяти.
• Диалог одноэтапной настройки.
• Представление загрузки сборки, позволяющее изучить потребление памяти статическими и динамическими сборками.
  Узнайте больше.
• Поддержка собственной среды представления Windows (WPF).
• Интеграция с Visual Studio 2010, 2012, 2013, 2015 и 2017, позволяющая начать профилирование приложения из среды IDE. Один щелчок запускает ANTS Memory Profiler в течение нескольких секунд с уже заданным путем к исполняемому файлу.

Видео

Начало работы с ANTS Memory Profiler

Краткий обзор некоторых функций ANTS Memory Profiler и того, как они упрощают профилирование памяти.

Посмотреть видео

Веб-семинары

5 заблуждений об управлении памятью .NET

На этом веб-семинаре Клайв Тонг обсуждает 5 наиболее распространенных заблуждений об управлении памятью .NET. Позже к нему присоединился ведущий разработчик ANTS Memory Profiler Эндрю Хантер для сеанса вопросов и ответов, где они ответили на вопросы о том, как работает управление памятью.

Посмотреть веб-семинар

Статьи

Обучение управлению памятью .NET

В этой бесплатной серии статей из 6 статей Рики Ликс собрал основные советы и методы для понимания управления памятью .NET, в том числе: заблуждения руководства

Как избежать автоматической сборки мусора

Понимание совместимости .NET

…и многое другое.

Начало изучения управления памятью .NET

Варианты лицензирования

Плавающая лицензия

Хотя мы не предлагаем плавающую лицензию, модель лицензирования Redgate включает оптовые скидки. Зачастую они более рентабельны, чем обычная модель плавающей лицензии, и позволяют всем вашим пользователям работать со своими инструментами одновременно, не дожидаясь, пока лицензия станет бесплатной.

В том случае, если схема оптовых скидок не облегчит вам жизнь, мы с радостью рассмотрим ваши обстоятельства и будем работать с вами, чтобы найти лучшее решение.

Персональные лицензии

Мы предлагаем скидку 50% на одну персональную лицензию для личного использования, использования любителями и домашнего использования. Эта лицензия недоступна для компаний.

Лицензии с открытым исходным кодом

Мы предлагаем ряд бесплатных лицензий для использования в ваших проектах с открытым исходным кодом. Узнайте больше

Лицензии для образования, некоммерческих организаций, благотворительных организаций и стартапов

За прошедшие годы мы помогли многим организациям в этих категориях, поэтому мы очень рады обсудить обстоятельства, связанные с нашим лицензированием. Пожалуйста, свяжитесь напрямую, чтобы узнать, как мы можем помочь.

Студенческие лицензии

Мы будем рады предоставить бесплатные лицензии для некоммерческого использования для отдельных учащихся в сфере образования после проверки. Пожалуйста, свяжитесь с нами, чтобы подать заявку на лицензию такого рода и получить дополнительную информацию.

Следуйте за нами

Внеклеточные ворота формируют энергетический профиль экспортера ABC

Внеклеточные ворота формируют энергетический профиль экспортера ABC

Скачать PDF

Скачать PDF

• Артикул
• Открытый доступ
• Опубликовано: 21 мая 2019 г.

• Седрик А. Дж. Хаттер ORCID: orcid.org/0000-0002-8920-3343 ¹ ,
• М. Хади Тимачи ² ,
• Леа М. Хюрлиманн ORCID: orcid.org/0000-0001-9907-7830 ¹ ,
• Иван Циммерманн ORCID: orcid.org/0000-0003-3476-4749 ¹ ,
• Паскаль Эглофф Orcid: Orcid.org/0000-0001-8948-3704 ¹ ,
• Хендрик Гёддеке ³ ,
• Svetlana Kucher ² ,
• Svetlana Kucher ² ,
• Svethabana ² ,
• Svethabana ² ,
• Svetlana Kucher ² ,
• Svetlana Kucher ² ,
• Svetlana Kucher ² ,
• . ORCID: orcid.org/0000-0002-8626-3033 ⁵ ,
• Ларс В. Шефер ORCID: orcid.org/0000-0002-8498-3061 ³ ,
• Энрика Бординьон ² и
• …
• Маркус А. Сигер ORCID: orcid.org/0000-0003-1761-8571 ¹  

Связь с природой том 10 , Номер статьи: 2260 (2019) Процитировать эту статью

• 5697 Доступ

• 36 цитирований

• 118 Альтметрический

• Сведения о показателях

предметов

• Биохимия
• Структурная биология

Abstract

Экспортеры ABC используют энергию АТФ для перекачивания субстратов через мембраны. Открытие и закрытие внеклеточных ворот являются ключевыми этапами транспортного цикла, но основной механизм плохо изучен. Здесь мы создали синтетическое однодоменное антитело (sybody), которое распознает гетеродимерный экспортер ABC TM287/288 исключительно в присутствии АТФ, что было необходимо для решения кристаллической структуры 3,2 Å обращенного наружу транспортера. sybody связывается с внеклеточным крылом и сильно ингибирует активность АТФазы, сдвигая конформационное равновесие транспортера в сторону обращенного наружу состояния, как показано с помощью двойного электрон-электронного резонанса (DEER). Мутации, которые облегчают открытие внеклеточных ворот, приводят к сравнимому сдвигу равновесия и сильно снижают активность АТФазы и транспорт лекарств. Используя sybody в качестве конформационного зонда, мы демонстрируем, что эффективное закрытие внеклеточных ворот необходимо для диссоциации димера NBD после гидролиза АТФ, чтобы вернуть транспортер обратно в его обращенное внутрь состояние.

Введение

Экспортеры ABC представляют собой универсальные мембранные белки, обнаруженные во всех типах жизни. Экспортеры типа I являются наиболее изученным классом экспортеров ABC и состоят как минимум из двух трансмембранных доменов (TMD), каждый из которых включает шесть трансмембранных спиралей и два домена связывания нуклеотидов (NBD), которые универсально консервативны среди всех транспортеров ABC. NBD претерпевают большие конформационные изменения в ответ на связывание и гидролиз АТФ, которые передаются в TMD через спирали связывания, чтобы принять конформации, обращенные внутрь (IF), обращенные наружу (OF) и закрытые наружу (Occ) конформации ¹ . Чередующийся доступ к TMDs в конъюгации с изменениями аффинности к транспортируемым субстратам делает возможным восходящий транспорт через липидный бислой ² . Полностью закрытые NBD стабилизируются двумя молекулами АТФ, связанными на поверхности димера, и совпадают с TMD, принимающими состояние OF или Occ ^3,4 . Переход в состояние IF требует, чтобы NBD разделялись, по крайней мере, до некоторой степени, процесс, который инициируется гидролизом АТФ ⁵ .

Многие экспортеры ABC, включая все семейство ABCC человека, имеют асимметричные сайты связывания АТФ, а именно вырожденный сайт, который может связывать, но не гидролизовать АТФ, и консенсусный сайт, который является гидролизоспособным ⁶ . Гетеродимер ТМ287/288 термофильной бактерии Thermotoga maritima был первым структурно проанализированным примером АВС-экспортера с вырожденным сайтом ^7,8 . Две близкородственные структуры IF TM287/288 были решены с помощью рентгеновской кристаллографии, либо они содержали одну молекулу AMP-PNP, связанную с вырожденным участком, либо не содержали нуклеотида. В отличие от большинства других структур IF экспортеров ABC, открытые NBD TM287/288 лишь частично разделены из-за контактов, опосредованных D-петлей вырожденного сайта, тогда как D-петля консенсусного сайта аллостерически связывает связывание АТФ в вырожденный сайт к гидролизу АТФ в консенсусном сайте ⁸ . Консенсусный сайт имеет искажения в мотиве Walker B, что предотвращает связывание нуклеотидов в транспортере IF ⁷ . Исследования DEER показали, что TM287/288 демонстрирует динамическое равновесие IF/OF в присутствии нуклеотидов и что захват нуклеотидов в консенсусном сайте необходим для сильного заселения состояния OF, тогда как в присутствии AMP-PNP транспортер преимущественно принимает свою IF. штат ⁹ .

Распределение на большие расстояния было обнаружено DEER во внеклеточных воротах TM287/288, что указывает на конформационную гибкость в этой внешней области ⁹ . Аналогичные наблюдения были зарегистрированы для ABCB1 ¹⁰ . Беспристрастное моделирование молекулярной динамики (МД) TM287/288 выявило спонтанные конформационные переходы из состояния IF через промежуточное соединение Occ в состояние OF ¹¹ . Многие симуляции оставались в ловушке в состоянии Occ, указывая на то, что открытие внеклеточных ворот представляет собой главный энергетический барьер в конформационном цикле. Интересно, что степень открывания внеклеточных ворот сильно различается у различных экспортеров ABC типа I в состоянии OF, тогда как ворота остаются закрытыми в состоянии Occ ^3,4,12 . Следовательно, события, происходящие во внеклеточных воротах, вероятно, играют ключевую роль в транспорте субстрата и должны быть аллостерически связаны с каталитическим циклом NBD. Тем не менее, лежащий в основе молекулярный механизм неизвестен.

В этой работе мы создали однодоменные антитела, которые связываются исключительно с OF TM287/288 и тем самым ингибируют транспортный цикл. Связующие были инструментальными для решения кристаллической структуры транспортера в его состоянии OF и использовались для исследования молекулярных событий во внеклеточных воротах и ​​их аллостерической связи с NBD.

Результаты

Конформационный захват TM287/288

Решив две близкородственные IF-структуры TM287/288, наша цель состояла в том, чтобы получить атомную структуру этого гетеродимерного ABC-экспортера в его состоянии OF. Анализ DEER показал, что TM287/288, несущий мутацию TM288 ^E517Q в мотиве Walker B консенсусного сайта (мутация EtoQ), был почти полностью захвачен в состоянии OF в присутствии ATP-Mg или ATPγS-Mg ⁹ . Для дальнейшего снижения остаточной АТФазной активности мутанта EtoQ (оборот 0,02  мин ^-1 ) в 6,5 раза, вместо этого мы ввели мутацию EtoA. Кроме того, мы создали однодоменные антитела (нанотела), которые распознают исключительно состояние OF TM287/288. С этой целью альпаки иммунизировали OF TM287/288, содержащим мотив сшитого тетраспирального пучка ¹³ (см. Методы). Этот подход привел к связыванию нанотела Nb_TM#1 исключительно с TM287/288 в присутствии (но не в отсутствие) АТФ, как показано с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (рис. 1d). Однако кристаллы, полученные с Nb_TM#1, дифрагировали недостаточно хорошо, чтобы построить достоверную модель. Поэтому мы выбрали синтетические нанотела (ситела) против TM287/288(EtoA) в присутствии АТФ-Mg полностью in vitro ¹⁴ . Таким образом, было создано более десяти OF-специфических sybody, и sybody Sb_TM # 35 было успешно использовано для определения структуры OF TM287/288 (EtoA) в присутствии ATPγS-Mg с разрешением 3,2 Å (рис. 1a, дополнительная таблица 1). ).

Рис. 1

Три обращенные наружу структуры TM287/288 в комплексе с однодоменными фрагментами антител. Транспортеры просматриваются вдоль плоскости мембраны (обозначены серым прямоугольником). a 3,2 Å структура TM287/288 (EtoA) в комплексе с ATPγS-Mg и специфичным для состояния sybody Sb_TM#35. b 3,5 Å структура TM287/288(2xDtoA/EtoA) в комплексе с ATPγS-Mg и нанотелом Nb_TM#1, зависящим от состояния. c 4,2 Å кристаллическая структура TM287/288 (2xDtoA/EtoA) в комплексе с ATPγS-Mg и нанотелом Nb_TM#2, не зависящим от состояния. d SPR-анализы в отсутствие (верхняя панель) и в присутствии (нижняя панель) АТФ с использованием иммобилизованного TM287/288 (EtoQ) в качестве лиганда и Sb_TM#35, Nb_TM#1 и Nb_TM#2 в качестве аналитов. Вводимые концентрации Sb_TM#35: 0, 9, 27, 81, 243, 729 нМ; Nb_TM#1: 0, 1, 3, 9, 27, 81 нМ; Nb_TM#2: 0, 0,9, 2,7, 8,1, 24,3, 72,9 нМ. Кинетический анализ показан в дополнительной таблице 2.

Полноразмерное изображение

Структура комплекса TM287/288-sybody

Sybody Sb_TM#35 связывается на вершине внеклеточного крыла TM287/288 (рис. 1a) и принимает решающее участие в установление кристаллических контактов (дополнительный рис. 1). Связывание опосредуется ароматическими остатками всех трех областей, определяющих комплементарность (CDR) sybody, которые зажаты между трансмембранными спиралями (TM) 1 и 2 TM287 и TM 5′ и 6′ TM288 (рис. 2a). Поскольку Sb_TM#35 связывается только в присутствии АТФ (рис. 1d), мы предположили, что он мешает каталитическому циклу транспортера. Действительно, антитело ингибировало АТФазную активность TM287/288 в детергенте (IC ₅₀ из 66,1 нМ, рис. 2b), а также восстановленный в нанодисках (дополнительный рис. 2b). Следует отметить, что ингибирование было менее эффективным в нанодисках, предположительно из-за нарушения доступности эпитопов sybody в контексте мембраны.

Рис. 2

sybody улавливает TM287/288 в состоянии OF. a Sybody Sb_TM#35 показан серым цветом, а CDR1, 2 и 3 выделены желтым, оранжевым и красным цветом соответственно. Четыре ароматических остатка (Y33, W52, Y59 и W113), которые вклиниваются между TM 1 и 2 TM287 (бирюзовый) и TM 5′ и 6′ TM288 (пурпурный), выделены палочками. b Ингибирование гидролиза АТФ TM287/288 с помощью Sb_TM#35, Nb_TM#1 и Nb_TM#2. Нерандомизированное тело служило контролем. Данные были сопоставлены с гиперболической функцией затухания для определения значений IC ₅₀ , а также остаточной активности. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения технических троек. c , d DEER-анализ пар спин-меток, введенных для исследования внеклеточных и внутриклеточных TMD и NBD ( c ), а также связывания sybody с транспортером ( д ). Следы DEER регистрировали в присутствии АТФ-ЭДТА с немеченым Sb_TM#35 или без него ( c ) или в присутствии АТФ-ЭДТА и спин-меченого Sb_TM#35 ( d ). На графиках показаны экспериментальные распределения расстояний, а вертикальные пунктирные линии, показанные в c  , показывают изменения средних расстояний замены и в качестве шаблона для построения модели мы решили две дополнительные структуры с низким разрешением (3,5–4,2 Å) транспортера OF, определенные в комплексе с нанотелами альпаки Nb_TM#1 и Nb_TM#2 (рис. 1b, c). Nb_TM#1 специфически распознает состояние OF и связывается с нижней частью закрытого димера NBD, занимая эпитоп, общий для NBD287 и NBD288 (рис. 1d). Было обнаружено, что сродни Sb_TM # 35, Nb_TM # 1, специфичный для состояния, ингибирует АТФазную активность транспортера (рис. 2b). Nb_TM#2 связывается сбоку с NBD288 и проявляет пикомолярное сродство к транспортеру независимо от того, присутствует ли АТФ или нет (рис. 1d, дополнительная таблица 2). Тем не менее, это нанотело частично ингибирует активность АТФазы примерно на 30% уже при самой низкой измеренной концентрации 20 нМ (рис. 2b). Поскольку для надежного измерения активности АТФазы концентрация TM287/288 должна быть не менее 8 нМ, мы не смогли определить IC ₅₀ значение для Nb_TM#2. Артефакт измерения можно исключить, поскольку неродственное контрольное тело не влияло на АТФазную активность транспортера (рис. 2б).

Переход от IF к OF делает TM287/288 более симметричным

Структура OF TM287/288 включает полностью димеризованные NBD, которые образуют сэндвич между двумя молекулами ATPγS-Mg в вырожденном и консенсусном сайтах (рис. 3a, дополнительная рис. 3). Почти идентичная структура (RMSD 0,21 Å) была также получена в присутствии АТФ-Mg (дополнительный рисунок 4c, дополнительная таблица 1). В отличие от NBD IF TM287/288, которые обнаруживают выраженную асимметрию между вырожденным и консенсусным сайтами, в основном в отношении D-петлей ⁸ закрытый димер NBD транспортера OF более симметричен (рис. 3а, дополнительная рис. 3). Кроме того, искажения, обнаруженные в каталитической диаде консенсусного сайта структуры IF (E517 ^TM288 и H548 ^TM288 ), релаксируют во время перехода в состояние OF, и два ключевых остатка принимают гидролизоспособное расположение (рис. 3б). Интересно, что в консенсусном сайте присутствуют два туннеля, которые позволили бы высвобождать расщепленный γ-фосфат (рис. 3c). TMD, состоящие из двух крыльев, каждое из которых включает шесть трансмембранных спиралей, полученных от обоих протомеров, широко открыты наружу (дополнительная рис. 4). При среднеквадратичном отклонении 1,73 Å структура TM287/288 больше всего напоминает структуру Sav1866. Кроме того, структура OF аналогична конформации OF TM287/288, предсказанной моделированием MD (дополнительный рисунок 5) ¹¹ , хотя при моделировании МД белок был встроен в липидный бислой вместо детергентной среды, используемой для кристаллизации. Также степень закрытия NBD и открытия внеклеточных ворот очень похожа между TM287/288 и Sav1866 (дополнительная рис. 6a). СКО между TM287 и TM288 уменьшается с 2,55 Å до 1,98 Å по мере того, как транспортер преобразуется из IF в конформацию OF, что указывает на то, что OF TM287/288 более симметричен (дополнительная рис. 6b). В то время как аналогичная степень симметрии наблюдалась между полутранспортерами OF ABCB1 (PDB: 6C0V, RMSD 2,07 Å), эквивалентные суперпозиции демонстрируют существенную асимметрию в структуре OF MRP1 (PDB: 6BHU, RMSD 4,54 Å), в основном из-за асимметрии TMD (дополнительный рис. 6b). Открытие внеклеточных ворот менее выражено в MRP1 и еще менее выражено в ABCB1, и ворота остаются почти полностью закрытыми в окклюзированной наружу структуре McjD 9.0358 4 (дополнительный рис. 6b). Следовательно, структуры экспортеров OF и Occ ABC демонстрируют наибольшую структурную изменчивость во внеклеточных воротах.

Рис. 3

Структурный анализ закрытого димера NBD. a Полностью закрытый димер NBD (NBD287 бирюзового цвета и NBD288 пурпурного цвета) размещает две молекулы ATPγS-Mg (показаны в виде палочек с соответствующей электронной плотностью) между мотивом Walker A (красный) и противоположным мотивом сигнатуры ABC (зеленый) в вырождены, а консенсусный сайт высокосимметричен. Остатки, участвующие в связывании и гидролизе АТФ, показаны палочками. b Наложение согласованного сайта связывания АТФ ранее решенной структуры IF (PDB: 4Q4A, светло-розовый) и структуры OF (пурпурный). Искажения каталитической диады (E517 ^TM288 и H548 ^TM288 ) ослабляются во время закрытия NBD, чтобы принять компетенцию гидролиза. Боковая цепь E517 ^TM288 была смоделирована в структуру TM287/288(EtoA). c Срез двух сайтов связывания нуклеотидов показывает два возможных P _и выходных туннелей в консенсусном сайте, которых нет в вырожденном сайте. ATPγS (частично вырезанный) показан в виде желтых палочек

Увеличенное изображение

sybody действует как молекулярный зажим

Интересно, что мы не обнаружили стерических столкновений, которые препятствовали бы связыванию Sb_TM#35 с транспортером IF. Следовательно, основываясь только на структурной информации, мы не могли объяснить, почему sybody ингибирует активность АТФазы. Поэтому мы использовали спектроскопию DEER, чтобы выяснить влияние тела на конформационный цикл.

Было обнаружено, что sybody смещает равновесие транспортера в сторону состояния OF, как было измерено в присутствии АТФ-ЭДТА (стрелки на рис. 2c). Выраженные эффекты наблюдались во внеклеточной области (54 ^TM287 /290 ^TM288 и 54 ^TM287 /271 ^TM287 ), а также при зондировании на расстоянии во внутриклеточной области ВНЧС (131 805 89358 3 TM2 TM288 ) и в NBD (460 ^TM287 /363 ^TM288 ) (рис.  2c и дополнительный рисунок 7). Далее мы наблюдали увеличение расстояния между двумя спиновыми метками, расположенными в крыле под телом (54 ^TM287 /290 ^TM288 ) в результате привязки sybody (пунктирные вертикальные линии на рис. 2c). Это говорит о том, что sybody действует как клин при раскрытом внеклеточном крыле. Как и ожидалось из-за отсутствия связывания sybody с состоянием IF, мы наблюдали незначительное влияние на межспиновые расстояния, когда TM287/288 инкубировали с sybody в отсутствие нуклеотидов (состояние апо) (дополнительная рис. 7).

Чтобы исследовать расположение связанного sybody относительно противоположного крыла, мы затем сосредоточились на расстоянии между sybody, помеченным в позиции 71, и спиновыми метками, введенными либо в 54 ^TM287 (крыло, прикрепляемое к телу) или 271 ^TM287 (противоположное крыло) транспортера (рис. 2d и дополнительный рис. 8). Пик основного расстояния, соответствующий дипольной связи между 71 ^Sb_TM#35 и 54 ^TM287 , был очень острым и с центром на 3,8 нм, в то время как он был несколько шире и с центром на 3,2 нм между 71 ^Sb_TM#35 и 271 ^TM2 разместили на противоположном крыле. Оба расстояния были видны только в присутствии АТФ и хорошо согласовывались с моделированием, основанным на структуре OF (дополнительный рисунок 8). Обе кривые также содержали пик расстояния около 5,2 нм, соответствующий остаточной доле димеров sybody в растворе. В заключение, sybody действует как молекулярный зажим, удерживающий внеклеточные ворота открытыми.

Законсервированные аспартаты запечатывают внеклеточные ворота

Показав, что sybody улавливает транспортер в полностью открытом состоянии, мы пришли к выводу, что мутации, облегчающие открытие внеклеточных ворот, окажут аналогичное влияние на энергетический ландшафт транспортера. В ИФ TM287/288, D41 ^TM287 и D65 ^TM288 , помещенных в TM1 соответствующего полутранспортера, устанавливаются водородные связи с амидами основной цепи противоположного крыла (рис. 4а). Следует отметить, что эти аспартаты сохраняются у бактериальных экспортеров ABC (рис. 4b), но не у эукариотических членов семейства. Когда аспартаты были заменены аланинами, АТФазная активность TM287/288 снизилась примерно в три раза для одиночных мутантов и примерно в 10 раз для двойного мутанта (далее называемого мутантом 2xDtoA) (рис. 4c).

Рис. 4

Внеклеточные ворота закрыты двумя законсервированными аспартатами. a Структура внеклеточных ворот TM287/288 в состоянии IF (слева, PDB: 4Q4H) и OF (справа), показанная на рисунке. D41 ^TM287 и D65 ^TM288 показаны в виде палочек и устанавливают водородные связи (желтые пунктирные линии) с пептидным остовом (показаны в виде палочек) соседних спиралей TM6 и TM6′, которые разрываются во время перехода IF-OF. b Выравнивание последовательностей бактериальных экспортеров ABC в области, содержащей консервативные аспартаты внеклеточных ворот. c АТФазная активность одиночных мутантов D41A ^TM287 и D65A ^TM288 и соответствующих двойных мутантов (2xDtoA) по сравнению с TM287/288 дикого типа определяли в детергенте. d Стимулируемая лекарственным средством АТФазная активность EfrEF дикого типа, одиночных мутантов D41A ^EfrE и D50A ^EfrF и соответствующих двойных мутантов (2xDtoA), восстановленных в протеолипосомы, определенная в отсутствие (базовая активность) или в присутствии этидия в указанных концентрациях. Данные нормализовали к базовой АТФазной активности соответствующего мутанта. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения технических троек. e Накопление этидия в клетках Lactococcus lactis , экспрессирующих EfrEF дикого типа, неактивный мутант Walker B E515Q ^EfrF или внеклеточные гейт-мутанты D41A ^EfrE и D50A ^{EfrAtomutant 9×0359 (или соответствующий 2 мутант Dx0359). f DEER анализирует внеклеточные и внутриклеточные TMD и NBD (те же позиции, что и на рис. 2c). Следы DEER регистрировали в присутствии АТФ-ЭДТА для транспортера дикого типа и для TM287/288 (2xDtoA). г Относительная АТФазная активность мутанта 2xDtoA в присутствии возрастающих концентраций Sb_TM#35, Nb_TM#1 и Nb_TM#2. Нерандомизированное тело служило контролем. Данные были сопоставлены с гиперболической функцией затухания для определения значений IC ₅₀ , а также остаточной активности. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения технических трехкратных повторов}

Изображение в натуральную величину

Используя снова АТФ-ЭДТА для индуцирования перехода IF в OF, анализ DEER выявил сдвиг равновесия в сторону состояния OF в мутанте 2xDtoA для всех спин-меченых пар ( Рис. 4f и дополнительный рис. 9). Сдвиг равновесия был аналогичен сдвигу, вызванному Sb_TM#35. Следовательно, аспартаты во внеклеточных воротах представляют собой энергетический барьер, который необходимо преодолеть, чтобы переключиться в состояние OF и повлиять на АТФазный цикл в дальнодействующей аллостерической связи, соединяющей внеклеточные ворота с NBD.

Чтобы изучить атомные детали конформационной динамики, лежащей в основе перехода IF-OF, мы выполнили МД-моделирование TM287/288 в липидном бислое POPC, начиная с кристаллической структуры IF (PDB: 4Q4A), после стыковки второго ATP-Mg молекула в консенсусный сайт ¹¹ и введение мутаций 2xDtoA во внеклеточные ворота. Как и в наших предыдущих MD-симуляциях TM дикого типа 287/288 ¹¹ , мы наблюдали спонтанные крупномасштабные конформационные переходы от конформации IF через состояние Occ к конформации OF; этот полный переход наблюдался в 3 из 20 независимых симуляций 500 нс (дополнительный рисунок 10). Несмотря на ограниченную статистику, переход происходит немного чаще, чем у дикого типа (6 из 100 симуляций 9).0358 11 ), в соответствии с нашими экспериментальными результатами и представлением о том, что полярные контакты двух остатков аспартата увеличивают энергетический барьер открытия внеклеточных ворот. Хотя МД-моделирование и экспериментальные данные согласуются, мы не можем исключить различные результаты, если эти довольно продолжительные моделирования проводились в липидном бислое, содержащем другие липиды, такие как, например, POPE ¹⁵ . Чтобы оценить стабильность структуры OF, о которой сообщается в этой работе, было проведено 20 независимых 400-нс симуляций как для дикого типа, так и для мутанта 2xDtoA. Хотя sybody не присутствует в моделировании, конформация OF с двумя связанными молекулами АТФ-Mg очень стабильна и просто колеблется вокруг рентгеновской структуры (дополнительный рисунок 11). Дополнительное контрольное моделирование в бислое POPE (вместо POPC) подтвердило этот результат (дополнительный рисунок 11), что делает маловероятным то, что состав липидов (с точки зрения головных групп PC и PE) оказывает большое влияние на АТФ-связанный Mg. структура ОФ.

Затем мы ввели мутации 2xDtoA в гетеродимерный экспортер ABC EfrEF Enterococcus faecalis (рис. 4b) ¹⁶ . Было обнаружено, что на профили стимулированной этидием АТФазной активности мембранно-восстановленного EfrEF сильно влияют одиночные мутации DtoA, и АТФазная активность EfrEF, содержащего мутации 2xDtoA, больше не может стимулироваться лекарственным средством (рис. 4d). Подтверждая это мнение, мутант TM287/288 (2xDtoA), воссозданный в нанодисках, демонстрировал сильно сниженную стимуляцию лекарственными препаратами Hoechst 33342 (дополнительный рисунок 2a). Затем мы экспрессировали EfrEF дикого типа и мутанты DtoA в Lactococcus lactis и отслеживали поглощение этидия с помощью измерений флуоресценции (рис. 4e). EfrEF дикого типа эффективно вытесняет этидий из клетки, что приводит к медленному увеличению накопления этидия, которое достигает низкого стационарного уровня. EfrEF, содержащий мутацию EtoQ в NBD, служил в качестве отрицательного контроля, демонстрируя высокие уровни накопления этидия ¹⁷ . Одиночные мутанты DtoA D41A ^EfrE и D50A ^EfrF частично утратили способность к оттоку этидия. Интересно, что кривая накопления мутанта 2xDtoA не достигает стационарного уровня в пределах временных рамок эксперимента. Это наблюдение предполагает дефект транспортера, приводящий к пассивному притоку этидия в клетку, опосредованному EfrEF, несущему мутации 2xDtoA. В заключение, внеклеточные аспартаты являются важными остатками-привратниками, которые аллостерически связаны с NBD и необходимы для транспорта субстрата.

Внеклеточный гейт-мутант и sybody проявляют синергизм

Поскольку как связывание sybody, так и ослабление внеклеточного гейта сдвигают конформационное равновесие в сторону состояния OF, мы пришли к выводу, что эти эффекты являются аддитивными. Действительно, при IC ₅₀ , равной 18,4 нМ (рис. 4g), ингибирование TM287/288, несущего мутации 2xDtoA, с помощью Sb_TM#35 оказалось более выраженным, чем ингибирование транспортера дикого типа (IC ₅₀ ). = 66,1 нМ) (рис. 2б). Кроме того, аффинность Sb_TM#35 к мутанту 2xDtoA ( K _D  = 14 нМ) был примерно в восемь раз выше, чем у транспортера дикого типа ( K _D  = 110 нМ) (дополнительный рисунок 12, дополнительная таблица 2). Аффинность также увеличивалась при введении мутации EtoA или EtoQ в консенсусный сайт транспортера ( K _D  = 66 нМ), который также демонстрирует сдвиг конформационного равновесия в сторону OF-состояния ⁹ и был самым высоким для комбинированный тройной мутант (2xDtoA/EtoA) ( K _D  = 8 нМ). Аналогичная картина наблюдалась для Nb_TM#1, который связывается с закрытым димером NBD. IC ₅₀ была значительно меньше при исследовании мутанта 2xDtoA ( K _D  = 16,8 нМ) по сравнению с TM287/288 дикого типа ( K _D  0= 4г). Это различие снова отражалось увеличением аффинности для мутанта 2xDtoA (37 нМ) по сравнению с транспортером дикого типа ( K _D  = 184 нМ), а самая высокая аффинность наблюдалась для тройного мутанта ( K _D  = 5 нМ) (дополнительный рисунок 12, дополнительная таблица 2). В заключение, Sb_TM#35 и Nb_TM#1 связываются с противоположными концами транспортера, но, тем не менее, демонстрируют очень сходное биофизическое поведение при захвате транспортера OF.

Исследование преобразования OF-IF с помощью связывающих веществ, специфичных для состояния

Наконец, мы проверили, могут ли нанотела, зависящие от состояния, использоваться в качестве зондов в SPR для исследования перехода OF-IF TM287/288. Когда иммобилизованный TM287/288 (EtoA) заряжали АТФ-Mg и затем промывали буфером, не содержащим нуклеотидов, максимальный сигнал связывания SPR для связывающих веществ, специфичных для состояния OF, Sb_TM#35 и Nb_TM#1 медленно уменьшался в течение временного окна в несколько часов (рис. 5а). Иммобилизованный TM287/288 был стабилен в течение этого времени, потому что максимальный сигнал связывания для неспецифического по состоянию нанотела Nb_TM#2 лишь немного уменьшился (рис. 5а). Впоследствии мы исследовали конверсию OF-IF с использованием либо АТФ-Mg (гидролизующие условия), либо АТФ-ЭДТА (связывание АТФ без гидролиза).

Рис. 5

Проверка перехода OF–IF с помощью связывателей, зависящих от состояния. a Примеры необработанных данных следов SPR, на основе которых было обнаружено конформационное зондирование. В нулевой момент времени иммобилизованный TM287/288 (EtoA) заряжали 1 мМ АТФ (красная стрелка) и вводили связующие вещества (серые стрелки) в насыщающих концентрациях (Sb_TM#35, 1 мкМ; Nb_TM#1, 500 нМ; Nb_TM# 2, 100 нМ) для получения максимальных значений единиц ответа (RU _max ) в указанные моменты времени. б РУ 9Значения 0515 max для дикого типа и мутантного TM287/288 были получены, как показано в a , путем зарядки транспортера 1  мМ АТФ либо в присутствии Mg ²⁺ (верхняя панель), либо ЭДТА (нижняя панель). Для связующих веществ Sb_TM#35 и Nb_TM#1, зависящих от состояния, данные были подобраны с использованием функции однофазного распада для определения значений периода полураспада ( t _1/2 ) состояния OF. Неспецифический для состояния Nb_TM#2 использовали в качестве контроля

Полноразмерное изображение

В случае TM287/288 дикого типа, загруженного АТФ-Mg или АТФ-ЭДТА, связывающие вещества, специфичные для состояния, не смогли распознать транспортер внутри временное разрешение эксперимента, показывающее быстрое преобразование в состояние IF. Напротив, состояние OF было долгоживущим, когда ATP-Mg окклюзировался EtoQ или мутантом EtoA. Время жизни в состоянии OF, измеренное связывающими веществами Sb_TM#35 или Nb_TM#1, специфичными для состояния, было очень сходным (9). 0459 t _1/2 из 45 или 49 минут для мутанта EtoQ и 287 или 268 минут для мутанта EtoA соответственно). Поразительно, но эти значения хорошо согласуются с периодом полураспада АТФ, гидролизованного этими мутантами, а именно 32 мин (мутант EtoQ) и 205 мин (мутант EtoA) при 25°C. Для тех же мутантов ситуация была обратной для АТФ-ЭДТА. Мутант EtoA легко превращался в состояние IF, сходное с транспортером дикого типа, тогда как состояние OF было очень стабильным для мутанта EtoQ ().t _1/2  = 112 или 95 мин соответственно). В этом случае АТФ не может гидролизоваться, и мы исследуем диссоциацию NBD со связанной АТФ (но без координации Mg ²⁺ ). Глутамин в мотиве Walker B, по-видимому, стабилизирует связывание АТФ в сэндвич-димере NBD, тогда как канонический глутамат или аланин в том же положении способствуют быстрой диссоциации NBD. Когда были введены мутации 2xDtoA, состояние OF было очень долгоживущим в случае АТФ-ЭДТА (t _1/2  = 297 или 281 мин соответственно). Это говорит о том, что ослабление внеклеточных ворот мутациями 2xDtoA сильно препятствует диссоциации NBD, тогда как диссоциация NBD транспортера дикого типа в этих экспериментальных условиях происходит очень быстро. Открытие NBD еще больше замедляется, если мутации 2xDtoA сочетаются с мутацией EtoA как для АТФ-Mg, так и для АТФ-ЭДТА.

Из этого набора данных можно сделать два основных вывода. Во-первых, гидролиз АТФ ослабляет димер NBD и необходим для сброса транспортера в состояние IF в физиологических условиях, когда АТФ и Mg ²⁺ присутствуют всегда. И, во-вторых, сильные контакты на внеклеточных воротах необходимы для оказания механической силы на NBD, чтобы облегчить быстрое открытие NBD, чтобы сбросить транспорт обратно в его IF-состояние.

Обсуждение

В этой работе мы раскрыли возможности однодоменных антител, специфичных для состояния, полученных от альпак и полностью in vitro из синтетических библиотек, для исследования мембранного переносчика на структурном и функциональном уровне. Стратегия создания обязательных документов для отдельных штатов против экспортеров ABC типа I имеет долгую историю, восходящую к 90-х годов прошлого века, когда было идентифицировано государственно-специфическое антитело ABCB1 UIC2 ¹⁸ . Недавняя крио-ЭМ структура ABCB1 в комплексе с UIC2 показала, что антитело зажимает внеклеточные петли вместе, тем самым предотвращая открытие внеклеточных ворот ¹⁹ . Молекулярное зажатие закрытых внеклеточных ворот также достигалось с помощью циклического пептида, индуцированного против CmABCB1 ²⁰ . Другими примерами связующих, которые предотвращают превращение IF-OF, являются нанотела, образующиеся против ABCB1 и PglK, которые оба стерически конфликтуют с закрытием NBD 9.0358 21,22 . Напротив, наши связующие специфичны для состояния OF и, следовательно, препятствуют превращению OF-IF.

Связывание Sybody с внеклеточным крылом TM287/288 было необходимо для решения структуры OF. И вырожденный, и консенсусный сайт связывания АТФ полностью закрыты и высокосимметричны, но только консенсусный сайт несет каталитическую диаду, расположенную для катализа гидролиза АТФ ²³ . Это говорит о том, что гидролиза АТФ только одного нуклеотида достаточно, чтобы инициировать диссоциацию NBD. В подтверждение этой точки зрения закрытые димеры NBD имеют два возможных P _и выходных туннелей на площадке консенсуса.

Сравнение с другими транспортными структурами OF и Occ выявило большую конформационную гетерогенность в степени открытия внеклеточных ворот, которая, как обсуждалось, играет потенциальную роль в выдавливании субстратов или предотвращении повторного связывания субстратов ^{3,4,10,12 ,24} . В этом исследовании мы раскрываем перекрестные помехи между внеклеточными воротами и циклом АТФазы, связь, которая, насколько нам известно, еще не исследована на молекулярном уровне (рис. 6). sybody, стабилизирующий открытое внеклеточное крыло, или мутации, ослабляющие внеклеточные ворота, смещают конформационное равновесие в сторону состояния OF. Предыдущие экспериментальные и вычислительные исследования показали, что закрытие NBD предшествует открытию внеклеточных ворот во время перехода IF-OF ^11,25 , и анализы DEER показали, что открытие внеклеточных ворот может быть частичным, в то время как NBD закрывается полностью ^9,10,26 . Следовательно, по-видимому, существует встроенный механический принцип, согласно которому открытие внеклеточных ворот требует больших энергетических затрат. И наоборот, используя наши нанотела, зависящие от состояния, в качестве конформационных зондов, мы смогли показать, что закрытие внеклеточных ворот связано с диссоциацией закрытого димера NBD после гидролиза АТФ. Наши эксперименты с EfrEF продемонстрировали, что плотно закрытые внеклеточные ворота на самом деле имеют решающее значение для функции транспортера. Кроме того, мутант 2xDtoA имел сильно сниженную активность АТФазы и утратил способность стимулироваться лекарственными препаратами. Это указывает на то, что закрытие внеклеточных ворот стало лимитирующей стадией каталитического цикла мутанта 2xDtoA. Следовательно, у этого мутанта превращение IF-OF больше не ограничивает скорость и, следовательно, не может стимулироваться связыванием лекарственного средства с направленным внутрь высокоаффинным сайтом (рис. 6).

Рис. 6

Роль внеклеточных ворот в транспортном цикле TM287/288. Субстрат (желтая звезда) связывается с транспортером IF (1) с высокой аффинностью, в то время как внеклеточные ворота закрыты двумя аспартатами (закрытый D-замок). Связывание и окклюзия двух молекул АТФ-Mg на интерфейсе NBD приводит к переходу в состояние OF (2). Внеклеточные ворота открываются (открытый D-замок) и высвобождается субстрат. Внеклеточные ворота пустой обращенной наружу полости закрываются (3) и, таким образом, могут запускать гидролиз АТФ в консенсусном сайте. Механическая сила прочно запечатанных внеклеточных ворот (закрытых D-замков) необходима для диссоциации NBD после гидролиза АТФ, чтобы сбросить транспортер в его IF-состояние

Изображение полного размера

Состояние OF, связанное с АТФ, с полностью закрытыми NBD упоминается как высокоэнергетическое состояние транспортного цикла, и в некоторых случаях предполагалось, что гидролиз АТФ необходим для заполнения состояния OF вообще. ^10,26 . Напротив, мы и др. ранее установили, что только связывание АТФ достаточно для конверсии IF-OF и высвобождения субстрата ^9,11,27 , в соответствии с моделью АТФ-переключателя ²⁸ . Следует отметить, что в то время как открытые внеклеточные ворота действительно представляют высокоэнергетическое состояние, в действительности верно обратное для закрытого димера NBD. Он принимает низкоэнергетическое состояние, и для диссоциации димера 9 требуется большое количество энергии.0358 29 . Это, безусловно, частично достигается гидролизом АТФ ^30,31 . Важно отметить, что наши результаты предполагают, что диссоциация NBD также включает механический компонент, опосредованный закрытием внеклеточных ворот. Еще одной возможностью является запуск гидролиза АТФ в результате закрытия внеклеточных ворот. Хотя это спекулятивно и напрямую не подтверждается и не исключается нашими данными, такой механизм гарантирует, что транспортер возвращается в состояние IF только после высвобождения субстрата.

Почему и когда гидролиз АТФ необходим для достижения активного транспорта, является постоянным предметом споров в области транспортеров ABC. Наши данные, представленные здесь и в предыдущих исследованиях ^9,11 , ясно показывают, что только связывание АТФ (в случае АТФ-ЭДТА, когда гидролиз АТФ не может происходить) достаточно для превращения IF-OF и, предположительно, для активного транспорта одной молекулы субстрата. Затем направленность транспорта достигается за счет аффинного переключения сайта связывания субстрата, который неизбежно подвергается радикальным перестройкам, когда TMD переключаются с IF на OF конформацию ¹² . Тем не менее маловероятно, что ABC-экспортер может эффективно работать только за счет связывания и диссоциации АТФ, потому что не хватает энергии, и молекулярные события будут управляться только медленными стохастическими броуновскими движениями. Чтобы сильно заселить состояние OF в физиологических условиях, ATP-Mg должен быть окклюзирован в консенсусном сайте закрытого димера NBD ³², состояние, которое может эффективно имитироваться мутацией Walker B EtoQ или EtoA ³³. Как мы показываем здесь с помощью наших зондов-биндеров, окклюзия АТФ прочно захватывает транспортер в состоянии OF и предотвращает цикличность транспортера. Следовательно, гидролиз АТФ, по-видимому, строго необходим для инициации диссоциации закрытого димера NBD. Как только АТФ гидролизуется, сила, создаваемая закрытыми внеклеточными воротами, облегчает диссоциацию NBD. Таким образом, наши результаты подтверждают представление о том, что гидролиз АТФ необходим для управления транспортным циклом на этапе сброса из состояния OF в состояние IF.

Мы надеемся, что наши результаты обеспечат механистическую основу для дальнейшего изучения функциональной роли внеклеточных ворот экспортеров ABC типа I и изучения молекулярной основы болезнетворных мутаций, обнаруженных во внеклеточной области важных с медицинской точки зрения экспортеров ABC, таких как MRP1. и CFTR ^34,35 .

Методы

Экспрессия и очистка

Гены, кодирующие гетеродимерный ABC-транспортер TM287/288, были амплифицированы и клонированы в pINIT_cat (добавочный ген: Plasmid #46858) ⁷ . Гены субклонировали в векторы экспрессии pBAD путем клонирования FX; ³⁶ для кристаллизации и биохимического анализа в вектор экспрессии pBXNh4L или в вектор экспрессии pBXNh4LCA для получения биотинилированных вариантов TM287/288 ¹⁴ .

Свежетрансформированные клетки MC1061 E. coli выращивали в среде Terrific Broth (TB) с добавлением 100  мкг/мл ампициллина до OD ₆₀₀ 1,0–1,5 при 37 °C, а экспрессию индуцировали добавлением 0,0017 % (масса/объем) L-арабинозы в течение 5 часов при 30 °C. Собирали клетки и готовили клеточные мембраны в 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 200 мМ NaCl и 10 % (об./об.) глицерина. Мембраны солюбилизировали добавлением 1% (мас./об.) н-додецил-β-D-мальтозида (β-DDM, Glycon) в течение 2 ч при 4°С. Солюбилизированные мембраны были дополнены 20 мМ имидазолом и загружены в самотечную колонку Ni-NTA Superflow (Qiagen) при 4 °C, промыты 20 объемами колонки 50 мМ имидазола, pH 7,5, 200 мМ NaCl, 10 % (об./об.) глицерина. и 0,03 % (мас. /об.) β-DDM или 0,3 % (мас./об.) н-децил-β-D-мальтозида (β-DM, Glycon) и элюировали 4 объемами колонки 200 мМ имидазола, рН 7,5, 200 мМ NaCl. , 10 % (об./об.) глицерина и 0,03 % (вес./об.) β-DDM или 0,3 % (вес./об.) β-DM с последующим обессоливанием с использованием колонки PD-10 (GE Healthcare, 17–0851–1 ) уравновешивают 20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,03 % (масса/объем) β-DDM или 0,3 % (масса/объем) β-DM. Его ₁₀ -метку отщепляли в течение ночи при 4 °C с использованием протеазы 3 C (1:10 масс./масс.) с последующей повторной загрузкой на колонку Ni-NTA с гравитационным потоком, уравновешенную 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl. , 40 мМ имидазола и 0,03% (масса/объем) β-DDM или 0,3% (масса/объем) β-DM при 4°C. Обработанный TM287/288 очищали эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,03 % (масса/объем) β-DDM или 0,3% (мас./об.) β-DM при 4 °C и концентрировали до желаемой концентрации с помощью концентратора Amicon Ultra-4 с отсечением по молекулярной массе (MWCO) 50 кДа. Очищенные варианты TM287/288 использовали сразу или мгновенно заморозили в жидком азоте и хранили при -80 °C.

Avi-меченые варианты TM287/288 были ферментативно биотинилированы с использованием BirA во время расщепления при 3 C в 20 мМ имидазола, pH 7,5, 200 мМ NaCl, 10 % (об./об.) глицерина, 10 мМ ацетата магния и 0,03 % (масс./об.) β-ДДМ и двукратный молярный избыток биотина.

EfrEF амплифицировали из геномной ДНК Enterococcus faecalis V583, клонировали в шаттл-вектор pREXNh4 посредством клонирования FX ³⁶ и субклонировали в вектор экспрессии pNZ8048Nh4 посредством клонирования с обменом остова вектора (VBEx) ³⁷ . Трансформированные клетки L. lactis NZ9000 ΔlmrAΔlmrCD ³⁸ выращивали в среде М17 с добавлением 0,5% глюкозы и 5  мкг/мл хлорамфеникола до ОП ₆₀₀ хлорамфеникола до ОП ₆₀₀ индуцировали экспрессию 1 при 30°С и добавляли экспрессию а 1 при 30°С. низинсодержащий культуральный супернатант L. lactis NZ9700 в течение 4 ч (1:5000 [об./об.]). Собирали клетки и готовили мембраны в 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 200 мМ NaCl и 10 % (об./об.) глицерина ¹⁶ . EfrEF очищали с использованием β-DDM таким же образом, как и TM287/288 (см. выше).

Нанотела/ситела были либо экспрессированы из pSb_init (адген: #110100) для биохимических экспериментов, либо субклонированы в pBXNPHM3 (аддген: #110099) путем клонирования FX для получения нанотел/сител без меток для кристаллизации и экспериментов DEER ^{14, 36} . Очищенные нанотела и синтела хранили при температуре -80 °С.

Мутагенез

Для ослабления внеклеточных ворот два консервативных аспартата были заменены аланинами в различных вариантах TM287/288, что привело к TM287/288(2xDtoA). Д41А ^TM287 вводили с использованием праймеров TM287_D41A_FW (GGC ACG TAT TGT CGC CGA AGG AAT CG C) и TM287_D41A_RV (GCG ATT CCT TCG GCG ACA ATA CGT GCC). D65A ^TM288 вводили с использованием праймеров TM288_D65A_FW (CAT AGG AAA AAC GAT CGC TGT TGT CTT CG) и TM288_D65A_RV (CGA AGA CAA CAG CGA TCG TTT TTC CTA TG). Чтобы сделать TM287/288 каталитически неактивным, E517A ^TM288 вводили в TM287/288 и TM287/288 дикого типа (2xDtoA) с использованием праймеров TM288_E517A_FW (CCT GAT ACT GGA CGC AGC CAC CAG CAA C) и TM288_E5GTT_RV (TM288_E517A_RV). GCT GGT GGC TGC GTC CAG TAT CAG G). Мутация D41A ^EfrE вводили с помощью праймеров EfrE_D41A_FW (CAA GTT GAT TGC TGT GGG CAT CG) и EfrE_D41A_RV (CGA TGC CCA CAG CAA TCA ACT TG). D50A ^EfrF был создан с использованием праймеров EfrF_D50A_FW (CAA TCG GGA TTG CTA ACC TCT TAG AAG C) и EfrF_D50A_RV (GCT TCT AAG AGG TTA GCA ATC CCG ATT G). Для сшивания транспортера в пучке тетраспирали в состоянии OF L200C ^TM287 вводили в cys-less TM287/288 (описано в ссылке ⁷ ) с использованием праймеров TM287_L200C_FW (GAG AAA ATC TCT GCG GTG TCA GGG TAG TGA G) и TM287_L200C_RV (CTC ACT ACC CTG ACA CCG CAG AGA TTT TCT C) и в сочетании с S224C ^TM288 с использованием праймеров TM288_S224C_FW (CAT AGA AGA AGA CAT CTG CGG CCT CAC TGT G) и TM288_S224C_RV (CAC AGT GAG GCC GCA GAT GTC TTC TTC TAT G).

Для спинового мечения sybody S71C вводили в Sb_TM#35 с использованием праймеров Sb_TM#35_S71C_FW (CAC GGT GTG CCT GGA CAA CG) и Sb_TM#35_S71C_RV (CGT TGT CCA GGC ACA CCG TG).

Для спин-мечения TM287/288 три новых цистеина были введены в TM287/288 без cys (для простоты называемые TM287/288 дикого типа). S271C ^TM287 был получен с использованием праймеров TM287_S271C_FW (CAG ATG GAG ATA GGA TGC ATC ATG GCA TAC) и TM287_S271C_RV (GTA TGC CAT GAT GCA TCC TAT CTC CAT CTG) в виде отдельного мутанта или в комбинации с K54C ^TM287 , который был генерировали с использованием праймеров TM287_K54C_FW (CTT TTC TCT GGT TTT GTG TAC AGG GAT CCT CAT G) и TM287_K54C_RV (CAT GAG GAT CCC TGT ACA CAA AAC CAG AGA AAA G). K54C ^TM287 также был получен в виде отдельного мутанта или в комбинации с I290C ^{TM288 9.0359 вводили с праймерами TM288_I290C_FW (CGC CTT GAA AGA CTG TAT CAC GGT GGG) и TM288_I290C_RV (CCC ACC GTG ATA CAG TCT TTC AAG GCG).}

Все очищенные мутантные белки были проанализированы с помощью SEC и не отличались по профилю элюирования и выходу от транспортера дикого типа.

Кристаллизация

Для кристаллизации TM287/288(EtoA) или TM287/288(2xDtoA/EtoA) в комплексе с Sb_TM#35 свежеочищенный транспортер в 0,3% (вес/объем) β-DM концентрировали примерно до 12 мг. /мл с использованием концентратора Amicon Ultra-4 (50 кДа MWCO) и очищенный Sb_TM#35 (хранящийся при –80 °C) добавляли в 1,1-кратном молярном избытке (конечная концентрация комплекса 10 мг/мл). Комплексы предварительно инкубировали с 2,5 мМ аденозин 5′-(3-тиотрифосфат) (ATPγS, Sigma, A1388) или 5 мМ АТФ, 3 мМ MgCl ₂ в течение 5–6 дней при 20 °C (без этой стадии инкубации кристаллы не дифрагировали с высоким разрешением), затем кристаллы выращивали методом диффузии пара в сидячих каплях (соотношение белок/резервуар 1:1) при 20 °С. Кристаллы собирали из лунок, содержащих либо 0,1 М ацетата натрия, рН 4,6, 0,035 М NaCl и 11,5% (вес/объем) ПЭГ6000 (структура, связанная с АТФγS), либо 0,1 М ацетата натрия, рН 4,6, 0,025 М NaCl и 12% масса/объем) ПЭГ6000 (структура, связанная с АТФ). Кристаллы появлялись в течение 1–3 дней и сразу же вылавливались. Кристаллы подвергали криозащите в 0,1 М растворе ацетата натрия, рН 4,6, 0,04 М растворе NaCl и 15 % (масса/объем) ПЭГ6000, дополнительно содержащем 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,3 % (масса/объем) β-ДМ. , 3 мМ MgCl ₂ , 1,25 мМ АТФγS или 5 мМ АТФ и 25% (об./об.) этиленгликоля и мгновенно заморожены в жидком азоте.

Для кристаллизации TM287/288(2xDtoA/EtoA) в комплексе с Nb_TM#1 к транспортеру, очищенному в 0,3% (масс./об.) β-ДМ в 1,2-кратный молярный избыток перед эксклюзионной хроматографией. После непродолжительной инкубации на льду комплекс отделяли от избытка нанотел эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,3% ж/об) β-ДМ. Комплексы транспортер/нанотело концентрировали до 10 мг/мл с использованием концентратора Amicon Ultra-4 (50 кДа MWCO) и инкубировали с 5 мМ ATPγS и 3 мМ MgCl9. 0515 2 на 15 мин на льду. Кристаллы выращивали методом диффузии паров в сидячих каплях (соотношение белка и резервуара 1:1) при 20 °С в 0,05 М глицина, рН 9,5, 0,225 М NaCl и 21% (об./об.) ПЭГ550ММЭ. Кристаллы появлялись в течение 2–3 дней и выращивались еще 3 недели. Кристаллы подвергали криозащите в резервуарном растворе, содержащем 10% (об./об.) ПЭГ400, и мгновенно замораживали в жидком азоте.

Для кристаллизации TM287/288(2xDtoA/EtoA) в комплексе с Nb_TM#2 к транспортеру, очищенному в 0,03% (масс./об.) 1,2-кратный молярный избыток перед эксклюзионной хроматографией. После непродолжительной инкубации на льду комплекс отделяли от избытка нанотел эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,03% масса/объем) β-ДДМ. Комплексы транспортер/нанотело концентрировали до 10 мг/мл с использованием концентратора Amicon Ultra-4 (50 кДа MWCO) и инкубировали с 2,5 мМ ATPγS и 3 мМ MgCl9. 0515 2 на 15 мин на льду. Кристаллы выращивали методом диффузии паров в сидячих каплях (соотношение белка к резервуару 1:1) при 20 °С в 0,1 М трис-HCl, рН 8,5, 0,1 М NaCl и 30% (об./об.) ПЭГ400. Кристаллы появлялись в течение 2–3 дней и выращивались еще 2–3 недели. Кристаллы подвергали мгновенной заморозке в жидком азоте без дополнительной криозащиты.

Сбор данных и определение структуры

Данные дифракции были собраны при длине волны 1,0 Å при 100 K на линиях пучка X06DA и X06SA в Swiss Light Source (SLS, Villigen, Швейцария). Данные дифракции обработаны программой XDS 9.0358 39 и усечено с использованием сервера анизотропии дифракции с настройками по умолчанию ⁴⁰ из-за сильной или сильной анизотропии, что привело к улучшению карт электронной плотности (дополнительная таблица 1, дополнительный рисунок 13).

Структура комплекса TM287/288(EtoA) – Sb_TM#35 – ATPγS-Mg была определена путем молекулярной замены в Phaser ⁴¹ с использованием модифицированной гомологической модели на основе Sav1866 (PDB: 2HYD). Кристаллы относятся к пространственной группе P2 ₁ , содержащей два гетеродимера TM287/288 и два синтела на асимметричное звено. После нескольких циклов построения модели в Coot ⁴² и уточнение в Buster (www.globalalphasing.com), полиаланиновая модель нанотела (PDB: 1ZVH) была вручную помещена в дополнительную электронную плотность. Многократные итерации построения модели в Coot и уточнения TLS в Buster привели к получению окончательной модели с хорошей геометрией (предпочтение/отклонения Рамачандрана: 96,54%/0,08%) (дополнительная таблица 1). Цепи A (TM287), B (TM288) и E (Sb_TM#35) использовали для структурного анализа и фигур.

Для определения структуры комплекса TM287/288(2xDtoA/EtoA) – Sb_TM#35 – ATP-Mg окончательная структура комплекса TM287/288(EtoA) – Sb_TM#35 – ATPγS-Mg была использована для уточнения по сравнению с TM287/288(2xDtoA/EtoA) – Sb_TM#35 – данные АТФ-Mg. Были введены мутации 2xDtoA, и ATPγS был заменен на ATP в Coot. Уточнение TLS в Buster привело к получению окончательной модели с хорошей геометрией (рекомендуется Ramachandran/выбросы: 96,58%/0,24%) (дополнительная таблица 1). Цепи A (TM287) и B (TM288) использовали для структурного сравнения со структурой комплекса TM287/288(EtoA) – Sb_TM#35 – ATPγS-Mg.

Структура комплекса TM287/288(2xDtoA/EtoA) – Nb_TM#1 – ATPγS-Mg была решена методом молекулярной замены в Phaser с использованием структуры TM287/288(EtoA) – Sb_TM#35 без sybody. Кристаллы принадлежат к пространственной группе P2 ₁ , содержащей два гетеродимера TM287/288 и два нанотела на асимметричную единицу. После нескольких циклов построения модели в Coot и уточнения в Buster, Phaser был использован для размещения отсутствующего нанотела с использованием модели гомологии, основанной на записи PDB 5OCL. Многочисленные итерации построения модели в Coot и уточнения TLS в Buster привели к получению окончательной модели с хорошей геометрией (рекомендуется Рамачандран/отклонения: 9).4,68%/0,24%) (дополнительная таблица 1). Для фигур использовали цепи A (TM287), B (TM288) и E (Nb_TM#1).

Структура комплекса TM287/288(2xDtoA/EtoA) – Nb_TM#2 – ATPγS-Mg была решена путем молекулярной замены в Phaser с использованием структуры TM287/288(EtoA) – Sb_TM#35 без sybody. Кристаллы относятся к пространственной группе P1, содержащей два гетеродимера TM287/288 и два нанотела на асимметричную единицу. После нескольких циклов построения модели в Coot и уточнения в Buster, Phaser был использован для размещения отсутствующего нанотела с использованием модели гомологии полиаланина, основанной на записи PDB 4LAJ. Многочисленные итерации построения модели в Coot и уточнения TLS в Buster привели к окончательной модели с разрешением 4,2 Å (рекомендуется Рамачандран/выбросы: 93,34%/0,83%) (дополнительная таблица 1). Для фигур использовали цепи A (TM287), B (TM288) и E (Nb_TM#2). Молекулярную графику и анализы выполняли в Pymol или с помощью UCSF Chimera ⁴³ .

Анализы АТФазы

Активность АТФазы измеряли путем обнаружения высвобожденного фосфата с использованием метода молибдат/малахитовая зеленая. Для обнаружения фосфата реакционный раствор (90 мкл) смешивали с профильтрованным раствором для обнаружения малахитовой зелени (160 мкл), состоящим из 10,5 мкг/мл молибдата аммония, 0,5 мкМ H ₂ SO ₄ , 0,34 мг/мл малахитового зеленого и 0,1% Triton X-100, поглощение измеряли при 650 нм ⁸ . Измерения активности АТФазы с белком, очищенным детергентом, проводили в АТФазном буфере, состоящем из 20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 10 мМ MgSO ₄ , содержащего 0,03% (масса/объем) β-DDM. Измерения активности ТМ287/288, восстановленных в нанодисках, проводили в том же буфере без детергента. Измерения EfrEF, восстановленного в протеолипосомах, проводили в 50 мМ HEPES pH 7,0 и 10 мМ MgSO 9 .0515 4 .

Относительная АТФазная активность TM287/288(D41A ^TM287 ), TM287/288(D65A ^TM288 ) и TM287/288(2xDtoA) по сравнению с TM287/288 дикого типа измерялась при 25 5°C в течение 25 5 мин. в присутствии 500 мкМ АТФ. Использовали 32 нМ TM287/288 дикого типа, 64 нМ одиночных вариантов DtoA TM287/288 и 128 нМ TM287/288 (2xDtoA) и соответствующую концентрацию TM287/288 (EtoQ) для вычитания фона.

Относительную АТФазную стимуляцию вариантов EfrEF в протеолипосомах этидием определяли при 30 °C в течение 15 мин в присутствии 1 мМ АТФ. Количество восстановленных вариантов EfrEF определяли с помощью количественного SDS-PAGE. Использовали 4 нМ EfrEF дикого типа, 23 нМ одиночных вариантов DtoA EfrEF и 15 нМ EfrEF (2xDtoA), а для вычитания фона брали контрольные буферы.

Ингибирование АТФазной активности TM287/288 и TM287/288 (2xDtoA) дикого типа в детергенте связующими определяли в присутствии 500 мкМ АТФ при 25 °C в течение 30 минут или 60 минут соответственно. Использовали 8 нМ TM287/288 дикого типа, а также TM287/288(2xDtoA), что более чем в 2 раза меньше самой низкой концентрации связующего (20 нМ). Для вычитания фона использовали равные количества TM287/288(EtoQ). Для получения значений IC ₅₀ данные по ингибированию аппроксимировали гиперболической кривой затухания со следующей функцией (SigmaPlot):

$$f = y_0 + (a \cdot {\mathrm{IC}}_{50})/\left( {\mathrm{IC}}_{50} + x} \right)$$

(1)

, где f соответствует активности АТФазы при соответствующей концентрации связующего вещества, деленной на активность АТФазы в отсутствие ингибитора, нормализованную до 100%, y ₀ соответствует остаточной активности при бесконечной концентрации связующего вещества , a соответствует максимальной степени ингибирования ( a  +  y ₀  = 100%), а x соответствует концентрации связующего.

Стимулированную АТФазную активность TM287/288 и TM287/288 (2xDtoA) дикого типа в нанодисках определяли при 37 °C в течение 30 минут в присутствии 500 мкМ АТФ и различных концентрациях Hoechst 33342. 40 нМ TM287/288 дикого типа, а также TM287/288 (2xDtoA) использовали для определения относительной стимуляции по сравнению с базовой активностью АТФазы с использованием буфера для вычитания фона.

Ингибирование активности АТФазы, стимулированное Hoechst 33342, в нанодисках определяли при 37 °C в течение 30 минут в присутствии 500 мкМ АТФ и 50 мкМ Hoechst 33342. 8 нМ TM287/288 дикого типа и 40 нМ TM287/288 в нанодиски использовались для определения активности АТФазы в присутствии или отсутствии 10 мкМ связующих веществ с использованием пустых нанодисков для вычитания фона.

Сшивание BMOE

Чтобы вырастить нанотела альпаки, специфически распознающие OF-состояние TM287/288, транспортер был сшит в тетраспиральном пучке, который формируется, когда переносчик принимает OF-состояние ¹³ . Два цистеина вводили в вариант TM287/288 без cys в положениях L200C ^{, TM287} и S224C ^{, TM288} посредством сайт-направленного мутагенеза. Кроме того, мутации 2xDtoA были введены в TM287/288_cl_L200C ^TM287 /S224C 9.0358 ТМ288 . Поскольку два цистеина находятся слишком далеко друг от друга, чтобы образовать дисульфидную связь, был использован малеимидный сшивающий агент BMOE (бисмалеимидоэтан, Thermo Scientific™, #22323) с длиной 8 Å. TM287/288_cl_L200C ^TM287 /S224C ^TM288 с мутациями 2xDtoA или без них экспрессировали, как описано выше. Мембраны солюбилизировали и очищали с помощью аффинной хроматографии Ni-NTA в присутствии 1 мМ дитиотреитола (DTT) в 0,03% (масса/объем) β-DDM. Буфер заменяли и ДТТ удаляли эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в PBS pH 7,4 и 0,03% (масса/объем) β-DDM при 4 °C и концентрированной до 50 мкМ. с концентратором Amicon Ultra-4 с MWCO 50 кДа. 10 мМ АТФ, 3 мМ MgCl ₂ и 5-кратный молярный избыток BMOE над транспортером, и сшивающую смесь инкубировали в течение 3 ч при 30°С. Смесь разводили в 5 раз и инкубировали с протеазой 3 C (1:10 вес/вес) в течение ночи при 4 °C. Перекрестно-сшитый и не содержащий метки транспортер был повторно загружен в колонку с гравитационным потоком Ni-NTA, уравновешенную 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 40 мМ имидазолом и 0,03% (вес / объем) β-DDM. Образец концентрировали с помощью концентратора Amicon Ultra-4 с MWCO 50 кДа, добавляли 10% (об./об.) глицерина, аликвоты подвергали мгновенной заморозке в жидком азоте и хранили при –80 °C для подготовки к эксклюзионной хроматографии. . Сшитый TM287/288_cl_L200C ^TM287 /S224C ^TM288 с мутациями 2xDtoA или без них очищали эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в 20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,03 % (мас./об.) β-DDM при 4 °C и концентрировали до 1 мг/мл с помощью концентратора Amicon Ultra-4 с MWCO 50 кДа и немедленно использовали для иммунизации альпаки.

Отбор нанотел и тел

Для отбора нанотел, специфичных для состояния OF, альпаку иммунизировали подкожными инъекциями четыре раза с двухнедельными интервалами, каждый раз 200 мкг очищенного сшитого TM287/288(2xDtoA)_cl_L200C ^TM287 /S224C ^TM288 в 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,03% (масса/объем) β-DDM. Иммунизация альпак была одобрена Кантональным ветеринарным управлением в Цюрихе, Швейцария (лицензия на эксперименты на животных № 188/2011). Кровь собирали через две недели после последней инъекции для получения РНК лимфоцитов, которую затем использовали для создания кДНК с помощью ОТ-ПЦР для амплификации репертуара VHH/нанотел. Были созданы библиотеки фагов и проведены два раунда фагового дисплея против TM287/288 (2xDtoA/EtoA), растворенных в β-DDM в присутствии 2  мМ ATP-Mg. После финального раунда отбора фагового дисплея 91,9-кратное обогащение определяли с помощью количественной ПЦР с использованием AcrB в качестве фона. Обогащенную библиотеку нанотел субклонировали в pSb_init путем клонирования FX, и 94 отдельных клона анализировали с помощью ELISA в присутствии 1 мМ АТФ-Mg. 27 положительных результатов ELISA были секвенированы по Сэнгеру и сгруппированы в три семейства в соответствии с длиной и последовательностью их CDR3 (среди них был Nb_TM#1). В другом отборе сшитые TM287/288_cl_L200C ^TM287 /S224C ^TM288 использовали для иммунизации альпаки, что привело к 51 положительному результату ELISA, из которых 24 были секвенированы по Сэнгеру и сгруппированы в четыре семейства связывающих веществ (среди них был Nb_TM#2).

Сителла были отобраны против TM287/288 (E517A) в β-DDM в присутствии 1 мМ АТФ-Mg с помощью нашей платформы для селекции in vitro ¹⁴ . После второго раунда фагового дисплея отдельные клоны анализировали на связывание с TM287/288 (E517A) в присутствии ATP-Mg с помощью ELISA. Секвенирование 48 положительных результатов ELISA привело к получению 40 уникальных последовательностей sybody ¹⁴ .

Спиновое мечение для DEER

Варианты цистеина TM287/288 были экспрессированы, как описано выше, и очищены с помощью аффинной хроматографии Ni-NTA в присутствии 2  мМ DTT. Для спинового мечения DTT удаляли на колонке PD-10 (GE Healthcare, 17-0851-1), уравновешенной 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,03% β-DDM и MTSL [(1-оксил -2,2,5,5-тетраметил-Δ3-пирролин-3-метил)метантиосульфонат, Toronto Research] добавляли в 10-кратном молярном избытке и инкубировали при 4 °C в течение ночи. Свободная спиновая метка была удалена эксклюзионной хроматографией на колонке Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,03% (масса/объем) β-DDM. при 4 °С. Образцы концентрировали до концентрации 30–50 мкМ с помощью концентраторов Amicon Ultra-4 с MWCO 50 кДа, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80 °C в готовом виде для экспериментов с DEER. Пары 131 ^TM288 /248 ^TM288 and 460 ^TM287 /363 ^TM288 were already used in previous studies ^8,9 , whereas the extracellular spin-label pairs 54 ^TM287 /271 ^TM287 and 54 ^TM287 /290 ^TM288 были сконструированы в рамках этого исследования, и была определена их АТФазная активность (дополнительная таблица 3).

Для сайт-специфического спинового мечения Sb_TM#35 один цистеин был введен в каркас sybody в положении 71 посредством сайт-направленного мутагенеза. Sb_TM#35_S71C экспрессировали из pBXNPHM3, как описано выше. Клетки собирали и ресуспендировали в PBS с pH 7,4 и 2 мМ DTT с добавлением ДНКазы (Sigma) и разрушали с помощью M-110P Microfluidizer® (Microfluidics™). Супернатант, дополненный 20 мМ имидазолом, наносили на колонку с гравитационным потоком Ni-NTA, промывали 20 колоночными объемами PBS pH 7,4, 50 мМ имидазолом и 2 мМ DTT и элюировали 4 колоночными объемами PBS pH 7,4, 300 мМ имидазолом и 2 мМ ДТТ.

На следующем этапе Sb_TM#35_S71C, слитый с His-меченым MBP, инкубировали с протеазой 3 C (1:10 вес/вес) при диализе против PBS pH 7,4 и 2 мМ DTT в течение ночи при комнатной температуре. Расщепленное sybody повторно загружали в гравитационную колонку Ni-NTA и элюировали тремя объемами колонки PBS pH 7,4, 40 мМ имидазолом и 2 мМ DTT с последующей эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Sepax-SRT10C SEC-300 (Sepax Technologies), уравновешенной с PBS pH 7,4 и 2 мМ DTT. Собирали пиковые фракции и удаляли DTT с использованием колонки PD-10 (GE Healthcare, 17-0851-1), уравновешенной дегазированным PBS с pH 7,0, при 4°C. Чтобы избежать захвата DTT, сителла элюировали 3,2 мл дегазированного PBS с pH 7,0 вместо 3,5 мл, предложенных производителем. Элюат концентрировали до 2,5 мл с использованием концентратора Amicon с MWCO 3 кДа. К образцу добавляли 5-кратный молярный избыток MTSL и инкубировали в течение 1 часа на льду, условие, которое ранее сообщалось для предотвращения мечения скрытых цистеинов, которые образуют универсально консервативную дисульфидную связь нанотел ⁴⁴ . Свободную метку удаляли и заменяли буфер с использованием колонки PD-10 (GE Healthcare, 17-0851-1), уравновешенной 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, и 150 мМ NaCl. Чтобы избежать захвата MTSL, сителла элюировали 3,2 мл 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, и 150 мМ NaCl. Спин-меченые sybody концентрировали до желаемой концентрации с помощью концентратора Amicon Ultra-4 с MWCO 3  кДа, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре –80 °C. Специфическое для сайта мечение было подтверждено и количественно определено с помощью масс-спектрометрии.

Измерения DEER

Эффективность мечения двойных цистеиновых мутантов транспортеров, солюбилизированных в детергенте, измеряли путем сравнения второго интеграла спектров, зарегистрированных при 25 °C с использованием ЭПР-спектрометра X-диапазона Miniscope 400 (Magnettech by Freiberg Instruments) со стандартным водным раствором TEMPOL. Расчетная эффективность спинового мечения двенадцати мутантов колебалась от 80% до 90%. Для измерения DEER в качестве криопротектора добавляли 10% (об./об.) D ₈ -глицерина. Диапазон конечных концентраций транспортера составлял от 15 до 25 мкМ. Образец (40 мкл) помещали в кварцевые пробирки с внешним диаметром 3 мм. Образец АТФ-ЭДТА содержал 2,5 мМ АТФ и 2,5 мМ этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) для полного ингибирования гидролиза АТФ; образцы инкубировали при 25 °C в течение 10 мин и быстро замораживали в жидком азоте. Для улавливания ванадата образцы инкубировали с 5 мМ ортованадата натрия, 2,5 мМ АТФ и 2,5 мМ MgCl 9 . 0515 2 на 3 мин при 50 °C и быстрой заморозке в жидком азоте. Немеченый Sb_TM#35 добавляли к TM287/288 в стехиометрическом соотношении ~1,3:1. Для измерения расстояний sybody-транспортер Sb_TM#35, меченный спином в положении 71, добавляли в стехиометрическом соотношении 0,5:1 к однократно меченым мутантам TM287/288 (54 ^TM287 и 271 ^TM287 ) в присутствии АТФ. — ЭДТА.

Измерения двойного электрон-электронного резонанса (DEER) проводились при 50 K на импульсном спектрометре Q-диапазона Bruker ELEXSYS E580Q-AWG (генератор сигналов произвольной формы), оборудованном усилителем TWT мощностью 150 Вт. Использовалась 4-импульсная последовательность DEER с гауссовским, неселективным наблюдателем и импульсами накачки длительностью 32 или 34 нс (соответствует 14 или 16 нс на полувысоте) с частотным разделением 100 МГц. Из-за когерентного характера импульсов, генерируемых генератором сигналов произвольной формы, для удаления эффекты бегущих эхо-сигналов от трассы DEER. Оценка данных DEER проводилась с помощью DeerAnalysis2015 ⁴⁵ . Фон первичных следов DEER корректировали с помощью растянутых экспоненциальных функций с однородными размерностями от 1,8 до 3 для разных выборок. Безмодельная регуляризация Тихонова использовалась для извлечения распределений расстояний из скорректированных по фону форм-факторов. Данные состояний апо и АТФ-ЭДТА, показанные для пар 131 ^TM288 /248 ^TM288 и 460 ^TM287 /363 ^TM288 в отсутствие sybody, воспроизводимы по сравнению с ранее опубликованными ⁹ . Моделирование межспинового расстояния было выполнено с помощью программного обеспечения MMM2015 с использованием библиотеки температуры окружающей среды MTSL ^46,47 .

Transport assay

L. lactis NZ9000 ΔlmrAΔlmrCD cells harboring the plasmids of wild-type or mutant EfrEF were grown in M17 medium supplemented with 0.5% glucose and 5 µg/ml chloramphenicol to an OD ₆₀₀ of 0. 4 –0,6 при 30 °C, а экспрессию индуцировали добавлением низинсодержащего культурального супернатанта L. lactis NZ9700 на 2 часа (1:1000 [об./об.]). Клетки промывали и ресуспендировали с использованием флуоресцентного буфера (50 мМ KP _и , pH 7,0 и 5 мМ MgSO ₄ ). Клетки разбавляли до ОП ₆₀₀ 0,5 и активировали путем добавления 0,5% глюкозы. Накопление 5 мкМ этидия контролировали при 30 °C с помощью флуоресцентного спектрометра LS-55 (Perkin Elmer, Шверценбах, Швейцария). Длины волн возбуждения и излучения (и ширина щелей) были установлены на 520 нм (10 нм) и 595 нм (15 нм) ^16,17 .

Восстановление в протеолипосомы

E. coli полярные липиды, экстрагированные из E. coli полные липиды (Avanti lipids 100500 P) и L-α-фосфатидилхолин (из яичного желтка, тип XVI≥CTL9-E,≉9 ) P3556 Sigma) растворяли в хлороформе. Липиды смешивали в соотношении 3:1 (вес/вес), хлороформ выпаривали и высушенные липиды растворяли в буфере для восстановления (50 мМ K-HEPES, pH 7,0). Липиды обрабатывали ультразвуком для получения небольших однослойных везикул (SUV). Внедорожники были мгновенно заморожены в жидком азоте и оттаивались четыре раза, чтобы сплавить их в большие мультиламеллярные везикулы (LMV). Наконец, большие однослойные везикулы (LUV) были сформированы путем экструзии LMV через поликарбонатный фильтр 400 нм. LUV разбавляли до рабочей концентрации 4 мг/мл и дестабилизировали с использованием 5,25 мМ Triton X-100. Очищенные детергентом варианты EfrEF добавляли к дестабилизированным липосомам в соотношении белок:липид 1:100. Молекулы детергента удаляли четырьмя циклами добавления и удаления 200 мг биогранул (полистироловые гранулы SM-2, Bio-Rad). Протеолипосомы собирали центрифугированием (40 000 об/мин, ротор 70 Ti, Beckman) и ресуспендировали в 50 мМ K-HEPES, pH 7,0·9.0358 16 .

Поверхностный плазмонный резонанс

Сродство связывания определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса при 25 °C с использованием системы ProteOn™ XPR36 Protein Interaction Array System (Biorad). Биотинилированные варианты TM287/288 были иммобилизованы на сенсорных чипах ProteOn™ NLC с плотностью 2000 RU. Нанотела и sybody, экспрессированные в pSb_init, подвергали гель-фильтрации в 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, и 150 мМ NaCl, а измерения SPR проводили в том же буфере, содержащем 0,015% (масс./об.) β-DDM и либо 1 мМ MgCl ₂ или 1 мМ MgCl ₂ и 0,5 мМ АТФ для измерения аффинности связывания в отсутствие или в присутствии АТФ соответственно. Каждое измерение проводилось один раз, и данные соответствовали модели взаимодействия 1:1 с использованием программного обеспечения BioRad Proteon Analysis. Чтобы определить периоды полураспада различных вариантов TM287/288, связанных с АТФ, все пять биотинилированных вариантов были иммобилизованы на сенсорных чипах ProteOn™ NLC с плотностью 3000 RU. Эксперимент проводился в 20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,015% (масса/объем) β-DDM и 1 мМ MgCl 9.0515 2 или 2,5 мМ ЭДТА при 25 °C и скорости потока 30 мкл/мин. Чтобы зарядить варианты транспортера АТФ-Mg или АТФ-ЭДТА, в начале эксперимента вводили буфер, содержащий 1 мМ АТФ вместе с 1 мМ MgCl ₂ или 2,5 мМ ЭДТА.

Препарат нанодиска

Мембранный каркасный белок MSP1E3D1 был субклонирован из pINITIAL (предоставлен проф. Раймундом Дутцлером) в pBXNh4 (дополнительный ген: плазмида № 47067) путем клонирования FX ³⁶ . Свежий преображенный MC1061 9Клетки E. coli 0459 выращивали в среде Terrific Broth (TB) с добавлением 100 мкг/мл ампициллина до OD ₆₀₀ 1,0–1,5 при 37 °C, а экспрессию индуцировали добавлением 0,0017% (масса/объем) L-арабинозу в течение ночи при 22 °C. Клетки собирали, ресуспендировали в лизирующем буфере (20 мМ Na-фосфата, pH 7,4, 1% (об./об.) Triton X-100 и 1 мМ PMSF) и разрушали с помощью M-110P Microfluidizer® (Microfluidics™). Клеточный дебрис осаждали при 8000 г в течение 30 мин при 4°С, а супернатант наносили на гравитационную колонку Ni-NTA, уравновешенную буфером для лизиса, промывали 10 объемами колонки с буфером 1 (40 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,3 М). NaCl и 1% (об./об.) Triton X-100), 10 объемов колонки, буфер 2 (буфер 1 + 50 мМ холата натрия), 10 объемов колонки, буфер A (40 мМ трис-HCl, pH 8,0 и 0,3 M NaCl), 10 колоночные объемы буфера А, содержащие 20 мМ имидазола, и, наконец, элюировали 4 колоночными объемами буфера А, содержащего 300 мМ имидазола. Добавляли протеазу 3 C (1:10 масс./масс.) и образец подвергали диализу в течение ночи при 4 °C против 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,5 мМ K-ЭДТА. На следующий день 2 мМ MgCl ₂ добавляли к образцу, который затем повторно загружали в колонку с гравитационным потоком Ni-NTA, уравновешенную 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 20 мМ имидазолом, и элюировали двумя объемами колонки с использованием того же буфера. Буфер заменяли путем трехкратного диализа против Tris-HCl pH 7,5 и 0,5 мМ K-EDTA в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Очищенный мембранный каркасный белок концентрировали до 60 мг/мл с использованием концентратора Amicon Ultra-4 с MWCO 10 кДа, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80°C.

Полярные липиды E. coli (экстракт полярных липидов E. coli , Avanti, 100600C) смешивали 3:1 (масс./масс.) с L-α-фосфатидилхолином из яичного желтка (Sigma, P3556) и хлороформом. испарился. Высушенные липиды растворяли в 20 мМ HEPES pH 8,0, 0,5 мМ K-ЭДТА, 100 мМ NaCl и 100 мМ холата до конечной концентрации 38 мкг/мл (50 мМ) и фильтровали с использованием фильтра 0,22 мкМ. Липиды, готовые для воссоздания нанодисков, хранили при температуре -80 °C.

Очищенные, биотинилированные варианты TM287/288, солюбилизированные в β-DDM, были преобразованы в нанодиски с использованием молярного соотношения липидов 240:8:1:MSP1E3D1:TM287/288. Чтобы сэкономить мембранный белок, идеальное соотношение липидов: MSP1E3D1 было определено заранее путем восстановления пустых нанодисков. Были протестированы различные соотношения в диапазоне от 25:1 до 40:1 (липид:MSP1E3D1). Пустые нанодиски загружали в колонку Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare) для отделения пустых нанодисков от мономерного MSP1E3D1 и агрегатов. Из профиля элюции было определено оптимальное соотношение липид:MSP1E3D1 30:1. Конечная концентрация холата в смеси для восстановления была доведена до 30 мМ. Смесь инкубировали при 25°С в течение 20 мин при покачивании со скоростью 650 об/мин. Затем к 200 мкл восстанавливающей смеси добавляли 200 мг биогранул, которые инкубировали в течение ночи при 4 °C при покачивании со скоростью 1000 об/мин. Биошарики удаляли с помощью центробежных фильтров 0,1 мкм из ПВДФ. Полные нанодиски отделяли от пустых нанодисков с помощью гель-фильтрации с использованием Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенного 20 мМ Tris-HCl pH 7,5 и 150 мМ NaCl. Профиль SEC, а также анализ SDS-PAGE воссозданного нанодиска TM287/288 показаны на дополнительном рисунке 2c. Варианты TM287/288, восстановленные в нанодисках, либо сразу использовали, либо мгновенно заморозили в жидком азоте и хранили при температуре -80 °C.

Моделирование MD

Настройка и параметры моделирования аналогичны нашей предыдущей работе ¹¹ . Вкратце, с помощью GROMACS ⁴⁸ было проведено МД-моделирование всех атомов TM287/288, встроенных в явно сольватированный бислой POPC. Следует отметить, что исходный организм TM287/288, гипертермофильная бактерия Thermotoga maritima , имеет уникальный липидный состав ⁴⁹ , который трудно реализовать для моделирования МД. Для моделирования, инициированного из структуры IF (PDB: 4Q4A), ATP-Mg был присоединен к консенсусному сайту, а D41 ^TM287 и D65 ^TM288 заменены аланинами. Мы провели 20 индивидуальных симуляций по 500 нс каждое (т.е. всего 10 мкс) при 375 K. Кроме того, было смоделировано состояние OF, начиная с кристаллической структуры (PDB: 6QUZ), показанной на рис. 1a, после удаления sybody и замены АТФγС посредством АТФ. Кроме того, тот же набор симуляций был проведен для структуры OF, связанной с АТФ, в которой мутации 2xDtoA были введены in silico (всего еще 8 мкс). Кроме того, была смоделирована рентгеновская структура ОВ дикого типа в бислое POPE (вместо POPC) при 375 K (десять симуляций по 500 нс каждая, т.е. всего 5 мкс).

Сводка отчета

Дополнительную информацию о дизайне исследования можно найти в Сводке отчета об исследовании природы, связанной с этой статьей.

Доступность данных

Данные, подтверждающие выводы этой рукописи, можно получить у соответствующих авторов по обоснованному запросу. Сводка отчета по этой статье доступна в виде файла с дополнительной информацией. Исходные данные, лежащие в основе рис. 2b, 4c, d, g и дополнительные рис. 2а, б представлены в виде файла исходных данных. Координаты структур TM287/288 депонированы под инвентарными номерами 6QUZ (Sb_TM#35, ATPγS-связанный), 6QV0 (Sb_TM#35, ATP-связанный), 6QV1 (Nb_TM#1) и 6QV2 (Nb_TM#2). Sybody Sb_TM#35 и нанотела Nb_TM#1 и Nb_TM#2 будут распространяться для научных исследований по обоснованному запросу.

Ссылки

1. Locher, K. P. Механистическое разнообразие переносчиков АТФ-связывающих кассет (ABC). Нац. Структура Мол. биол. 23 , 487–493 (2016).

   КАС пабмед Статья Google ученый

2. Рамачандра, М. и др. Р-гликопротеин человека проявляет пониженное сродство к субстратам во время каталитического переходного состояния. Биохимия 37 , 5010–5019(1998).

   КАС пабмед Статья Google ученый

3. «>

   Доусон, Р. Дж. и Лочер, К. П. Структура бактериального транспортера ABC с несколькими лекарственными средствами. Природа 443 , 180–185 (2006).

   ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед Статья Google ученый

4. Choudhury, H.G. et al. Структура антибактериального пептидного АТФ-связывающего кассетного транспортера в новом закрытом состоянии. Проц. Натл акад. науч. США 111 , 9145–9150 (2014).

   ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

5. Джордж А. М. и Джонс П. М. Взгляды на структурно-функциональные транспортеры ABC: модели переключения и постоянного контакта. Прог. Биофиз. Мол. биол. 109 , 95–107 (2012).

   КАС пабмед Статья Google ученый

6. Procko, E. , O’Mara, M.L., Bennett, W.F., Tieleman, D.P. & Gaudet, R. Механизм переносчиков ABC: общие выводы из структурных и функциональных исследований переносчика антигенных пептидов. FASEB J. 23 , 1287–1302 (2009).

   КАС пабмед Статья Google ученый

7. Hohl, M., Briand, C., Grütter, M.G. & Seeger, M.A. Кристаллическая структура гетеродимерного переносчика ABC в его обращенной внутрь конформации. Нац. Структура Мол. биол. 19 , 395–402 (2012).

   КАС пабмед Статья Google ученый

8. Hohl, M. et al. Структурная основа аллостерических взаимодействий между сайтами связывания асимметричных нуклеотидов гетеродимерного экспортера ABC. Проц. Натл акад. науч. США 111 , 11025–11030 (2014 г.).

   ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

9. «>

   Timachi, M.H. et al. Изучение конформационных равновесий гетеродимерного транспортера ABC. eLife 6 , e20236 (2017).

10. Verhalen, B. et al. Трансдукция энергии и альтернирующий доступ к транспортеру ABC P-гликопротеина млекопитающих. Природа 543 , 738–741 (2017).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

11. Göddeke, H. et al. Атомистический механизм крупномасштабного конформационного перехода в гетеродимерном АВС-экспортере. Дж. Ам. хим. соц. 140 , 4543–4551 (2018).

    ПабМед Статья КАС Google ученый

12. Johnson, Z. L. & Chen, J. Связывание АТФ обеспечивает высвобождение субстрата из белка множественной лекарственной устойчивости 1. Cell 172 , 81–89 (2018).

    КАС пабмед Статья Google ученый

13. «>

    Доши Р. и др. Молекулярное нарушение силового хода в АТФ-связывающей кассете транспортного белка MsbA. Дж. Биол. хим. 288 , 6801–6813 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

14. Zimmermann, I. et al. Синтетические однодоменные антитела для конформационного захвата мембранных белков. eLife 7 , e34317 (2018).

15. Иммадизетти, К., Хеттидж, Дж. и Моради, М. Липидозависимый механизм чередующегося доступа бактериального мультинаркотического экспортера ABC. АКЦ Цент. науч. 5 , 43–56 (2019).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

16. Hürlimann, L.M. et al. Гетеродимерный переносчик ABC EfrCD опосредует отток многих лекарств у Enterococcus faecalis . Антимикроб. Агенты Чемотер. 60 , 5400–5411 (2016).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

17. Хюрлиманн, Л. М., Холь, М. и Сигер, М. А. Разделение задач асимметричных сайтов связывания нуклеотидов в гетеродимерном экспортере ABC EfrCD. FEBS J. 284 , 1672–1687 (2017).

    ПабМед Статья КАС Google ученый

18. Mechetner, E.B. & Roninson, I.B. Эффективное ингибирование множественной лекарственной устойчивости, опосредованной P-гликопротеином, с помощью моноклонального антитела. Проц. Натл акад. науч. США 89 , 5824–5828 (1992).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

19. Алам, А. и др. Структура зосуквидара и связанного с UIC2 химерного человека-мыши ABCB1. Проц. Натл акад. науч. США 115 , E1973–E1982 (2018).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

20. Кодан, А. и др. Структурная основа механизмов ворот эукариотического гомолога Р-гликопротеина. Проц. Натл акад. науч. США 111 , 4049–4054 (2014).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

21. Перес, К. и др. Структурные основы ингибирования липид-связанной олигосахаридной флиппазы PglK конформационным нанотелом. наук. Респ. 7 , 46641 (2017).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

22. Уорд, А. Б. и др. Структуры P-гликопротеина обнаруживают его конформационную гибкость и эпитоп на нуклеотид-связывающем домене. Проц. Натл акад. науч. США 110 , 13386–13391 (2013).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

23. Зайцева Дж., Дженевейн С., Джамперц Т., Холланд И. Б. и Шмитт Л. H662 является стержнем гидролиза АТФ в нуклеотидсвязывающем домене транспортера ABC HlyB. Эмбо Дж. 24 , 1901–1910 (2005).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

24. Perez, C. et al. Структура и механизм действия активной липид-связанной олигосахаридной флиппазы. Природа 524 , 433–438 (2015).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед Статья Google ученый

25. Сорум, Б., Чеге, Д. и Чанади, Л. Время раскрытия пор CFTR и структура его переходного состояния. Cell 163 , 724–733 (2015).

    КАС пабмед Статья Google ученый

26. Мишра, С. и др. Конформационная динамика нуклеотидсвязывающих доменов и мощность гетеродимерного транспортера ABC. eLife 3 , e02740 (2014 г.).

27. Джонсон Э. Э. и Весслинг-Ресник М. Метаболизм железа и врожденный иммунный ответ на инфекцию. Заражение микробами. 14 , 207–216 (2012).

    КАС пабмед Статья Google ученый

28. Хиггинс, С. Ф. и Линтон, К. Дж. Модель переключателя ATP для транспортеров ABC. Нац. Структура Мол. биол. 11 , 918–926 (2004).

    КАС пабмед Статья Google ученый

29. Szollosi, D., Szakacs, G., Chiba, P. & Stockner, T. Анализ сил, которые преобладают над димеризацией доменов связывания нуклеотидов ABCB1. Биофиз. J. 114 , 331–342 (2018).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ пабмед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

30. Зайцева Дж. и др. Структурный анализ асимметрии, необходимой для каталитической активности димера домена ABC-ATPase. Embo J. 25 , 3432–3443 (2006).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

31. Prieβ, M., Göddeke, H., Groenhof, G. & Schäfer, LV. Молекулярный механизм гидролиза АТФ в переносчике ABC. АКЦ Цент. науч. 4 , 1334–1343 (2018).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

32. Urbatsch, I.L., Sankaran, B., Weber, J. & Senior, A.E. P-гликопротеин стабильно ингибируется индуцированным ванадатом захватом нуклеотида в одном каталитическом сайте. Дж. Биол. хим. 270 , 19383–19390 (1995).

    КАС пабмед Статья Google ученый

33. Orelle, C., Dalmas, O., Gros, P., Di Pietro, A. & Jault, J.M. Консервативный остаток глутамата, примыкающий к мотиву Walker-B, является каталитической основой для гидролиза АТФ в АТФ- связывающий кассетный транспортер BmrA. Дж. Биол. хим. 278 , 47002–47008 (2003 г.).

    КАС пабмед Статья Google ученый

34. Корради, В., Вергани, П. и Тилеман, Д. П. Трансмембранный регулятор проводимости кистозного фиброза (CFTR) закрытые и открытые модели каналов. Дж. Биол. хим. 290 , 22891–22906 (2015).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

35. Weigl, K.E. et al. Обращенная наружу ароматическая аминокислота имеет решающее значение для передачи сигналов между трансмембранными и нуклеотидсвязывающими доменами белка 1 множественной лекарственной устойчивости (MRP1; ABCC1). Мол. фарм. 94 , 1069–1078 (2018).

    КАС Статья Google ученый

36. Гертсма, Э. Р. и Дутцлер, Р. Универсальный и эффективный высокопроизводительный инструмент клонирования для структурной биологии. Биохимия 50 , 3272–3278 (2011).

    КАС пабмед Статья Google ученый

37. Гертсма, Э. Р. и Пулман, Б. Высокопроизводительное клонирование и экспрессия в рекальцитрантных бактериях. Нац. Методы 4 , 705–707 (2007).

    КАС пабмед Статья Google ученый

38. Venter, H. et al. Сходство между АТФ-зависимыми и ионно-связанными переносчиками многих лекарств. Биохим Соц. Транс. 33 , 1008–1011 (2005).

    КАС пабмед Статья Google ученый

39. «>

    Кабш, В. XDS. Acta Crystallogr D. Biol. Кристаллогр 66 , 125–132 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

40. Strong, M. et al. К структурной геномике комплексов: кристаллическая структура белкового комплекса PE/PPE из Mycobacterium tuberculosis. Проц. Натл акад. науч. США 103 , 8060–8065 (2006 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

41. McCoy, A.J. et al. Кристаллографическая программа Phaser. J. Appl Crystallogr 40 , 658–674 (2007).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

42. Эмсли П., Локамп Б., Скотт В. Г. и Коутан К. Особенности и развитие Coot. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 66 , 486–501 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

43. Pettersen, E. F. et al. Химера UCSF — система визуализации для поисковых исследований и анализа. J. Comput Chem. 25 , 1605–1612 (2004).

    КАС пабмед Статья Google ученый

44. Pleiner, T. et al. Нанотела: сайт-специфическое мечение для визуализации сверхвысокого разрешения, быстрого картирования эпитопов и выделения нативных белковых комплексов. eLife 4 , e11349 (2015 г.).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

45. Йешке, Г. и др. DeerAnalysis2006 — комплексный программный пакет для анализа импульсных данных ELDOR. Appl Magn. Reson 30 , 473–498 (2006).

    КАС Статья Google ученый

46. Йешке, Г. Ю. МММ: набор инструментов для интегративного структурного моделирования. Науки о белках. 27 , 76–85 (2018).

    КАС пабмед Статья Google ученый

47. Polyhach, Y., Bordignon, E. & Jeschke, G. Ротамерные библиотеки спин-меченых цистеинов для исследований белков. Физ. хим. хим. физ. 13 , 2356–2366 (2011).

    КАС пабмед Статья Google ученый

48. Абрахам, М. Дж. и др. GROMACS: высокопроизводительное молекулярное моделирование посредством многоуровневого параллелизма от ноутбуков до суперкомпьютеров. Программное обеспечениеX 1-2 , 19–25 (2015).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья Google ученый

49. «>

    Damste, J. S. et al. Структурная характеристика тетраэфира, тетраэфира и смешанного эфира/эфира на основе диаболовой кислоты, трансмембранных липидов бактерий из порядка Thermotogales. Арх. Микробиол . 188 , 629–641 (2007).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

Скачать ссылки

Благодарности

Мы благодарим всех членов лаборатории Seeger за стимулирующие обсуждения. Мы благодарим Beat Blattmann и Céline Stutz-Ducommun из Центра кристаллизации белков UZH за проведение скрининга кристаллизации, а также сотрудников линий SLS X06SA и X06DA за их поддержку во время сбора данных. Э.Б. хотел бы поблагодарить G. Jeschke (ETH Zurich) за предоставленный резонатор Q-диапазона. Вычислительный центр Steinbuch (SCC) в Карлсруэ/Германия предоставил вычислительные ресурсы. Институт медицинской микробиологии и Цюрихский университет признательны за финансовую поддержку. М.К. благодарит Канадский совет по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) и Канадскую программу научных исследований за финансовую поддержку. Эта работа финансировалась профессором SNF Швейцарского национального научного фонда (PP00P3_144823, MAS) и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) в рамках Стратегии превосходства Германии — EXC-2033 — проект № 39.0677874, Грант Эмми Нётер для L.V.S. (SCHA 1574/3-1) и исследовательский грант Э.Б. (BO 3000/1–2 и INST 130/972-1 FUGG).

Информация об авторе

Авторы и организации

1. Институт медицинской микробиологии Цюрихского университета, Gloriastr. 28/30, 8006, Цюрих, Швейцария

   Седрик А. Дж. Хюттер, Леа М. Хюрлиманн, Иван Циммерманн, Паскаль Эглофф и Маркус А. Зеегер

2. Факультет химии и биохимии, Рурский университет Бохума, 44801, Бохум, Германия

   M. Hadi Timachi, Svetlana Kucher & Enrica Bordignon

3. Theoretical Chemistry, Faculty of Chemistry and Biochemistry, Ruhr University Bochum, 44801, Bochum, Germany

   Hendrik Göddeke & Lars V. Schäfer

4. Institute of Parasitology , Университет Цюриха, Винтертурерштрассе 266а, 8057, Цюрих, Швейцария

   Саша Штефанич

5. Кафедра химии и кафедра прикладной математики, Университет Западного Онтарио, Лондон, Онтарио, N6A 3K7, Канада

   Mikko Karttunen

Авторы

1. Cedric A. J. Hutter

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

2. M. Hadi Timachi

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

3. Lea M. Hürlimann

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Академия

4. Iwan Zimmermann

   Посмотреть публикации автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

5. Pascal Egloff

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

6. Hendrik Göddeke

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

7. Светлана Кучер

   Посмотреть публикации автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

8. Saša Štefanić

   Посмотреть публикации автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

9. Mikko Karttunen

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

10. Ларс В. Шефер

    Просмотр публикаций автора

    Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

11. Enrica Bordignon

    Просмотр публикаций автора

    Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

12. Markus A. Seeger

    Просмотр публикаций автора

    Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

Вклады

C.A.J.H., E.B. и M.A.S. задумал исследование. C.A.J.H., I.Z., PE и S.S. выбрали нанотела и ситела против TM287/288. C.A.J.H. очистили и кристаллизовали белковые комплексы и решили их структуру. Л.М.Х. провели функциональные и биохимические эксперименты с EfrEF. C.A.J.H. и Л.М.Х. провел все функциональные эксперименты с TM287/288. C.A.J.H. клонировали, очищали и метили все образцы для анализа DEER. М.Х.Т. провел большую часть анализов и моделирования DEER и обсудил результаты с Э.Б.С.К. провел эксперименты DEER с переносчиком тела и обсудил их с Э. Б. и L.V.S., C.A.J.H., M.H.T., L.M.H., H.G. и M.A.S. созданные фигуры. C.A.J.H., L.V.S., E.B. и M.A.S. написал рукопись, и все авторы редактировали рукопись.

Авторы переписки

Переписка с Энрика Бординьон или Маркус А. Сигер.

Заявление об этике

Конкурирующие интересы

Авторы не заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Дополнительная информация

Информация о рецензировании журнала: Nature Communications благодарит Берта Пулмана и других анонимных рецензентов за их вклад в рецензирование этой работы. Доступны отчеты рецензентов.

Примечание издателя: Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Дополнительная информация

Дополнительная информация

Файл рецензирования

Отчет. Международная лицензия Creative Commons Attribution 4.

0, которая разрешает использование, совместное использование, адаптацию, распространение и воспроизведение на любом носителе или в любом формате, при условии, что вы укажете автора(ов) оригинала и источник, предоставив ссылку на лицензию Creative Commons , и укажите, были ли внесены изменения. Изображения или другие сторонние материалы в этой статье включены в лицензию Creative Commons для статьи, если иное не указано в кредитной строке материала. Если материал не включен в лицензию Creative Commons статьи, а ваше предполагаемое использование не разрешено законом или превышает разрешенное использование, вам необходимо получить разрешение непосредственно от правообладателя. Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Перепечатка и разрешения

Об этой статье

Дополнительная литература

• Структурная идентификация сайтов связывания сосудорасширяющих средств на субъединице SUR2

  • Дайан Дин
  • Цзин-Сян Ву
  • Лэй Чен

  Nature Communications (2022)

• Структура и механизм оттока дрожжевого переносчика плейотропной лекарственной устойчивости Pdr5

  • Анджей Харрис
  • Мануэль Вагнер
  • Лутц Шмитт

  Nature Communications (2021)

• Усовершенствованная флуоресцентная метка и ее нанотела для экспрессии мембранных белков, анализа стабильности и очистки.

  
  • Хунмин Цай
  • Хэбанг Яо
  • Дианфан Ли

  Биология коммуникации (2020)

• Создание синтетических нанотел против деликатных белков

  • Иван Циммерманн
  • Паскаль Эглофф
  • Маркус А. Сигер

  Природные протоколы (2020)

• Механика и фармакология отбора и транспорта субстрата эукариотическими экспортерами ABC

  • Шрирам Шрикант
  • Рашель Годе

  Природа Структурная и молекулярная биология (2019)

Комментарии

Отправляя комментарий, вы соглашаетесь соблюдать наши Условия и Правила сообщества. Если вы обнаружите что-то оскорбительное или не соответствующее нашим условиям или правилам, отметьте это как неприемлемое.

Ворота из красного кирпича с металлическим профилем на белом векторном изображении

Ворота из красного кирпича с металлическим профилем на белом векторном изображении

1. лицензионные векторы
2. Векторы ворот

ЛицензияПодробнее

Стандарт Вы можете использовать вектор в личных и коммерческих целях. Расширенный Вы можете использовать вектор на предметах для перепродажи и печати по требованию.

Тип лицензии определяет, как вы можете использовать этот образ.

г.

	стд.	Расшир.
Печатный/редакционный
Графический дизайн
Веб-дизайн
Социальные сети
Редактировать и изменять
Многопользовательский
Товары для перепродажи
Печать по запросу

Способы покупкиСравнить

Плата за изображение € 14,99 Кредиты € 1,00 Подписка € 0,69

Оплатить стандартные лицензии можно тремя способами. Цены евро евро .

г.

Оплата с помощью	Цена изображения
Плата за изображение € 14,99 Одноразовый платеж
Предоплаченные кредиты € 1 Загружайте изображения по запросу (1 кредит = 1 евро). Минимальная покупка 30р.
План подписки От 0,69 € Выберите месячный план. Неиспользованные загрузки автоматически переносятся на следующий месяц.

Способы покупкиСравнить

Плата за изображение € 39,99 Кредиты € 30,00

Существует два способа оплаты расширенных лицензий. Цены евро евро .

Оплата с помощью	Стоимость изображения
Плата за изображение € 39,99 Оплата разовая, регистрация не требуется.
Предоплаченные кредиты € 30 Загружайте изображения по запросу (1 кредит = 1 евро).

Дополнительные услугиПодробнее

Настроить изображение Доступно только с оплатой за изображение € 85,00

Нравится изображение, но нужны лишь некоторые изменения? Пусть наши талантливые художники сделают всю работу за вас!

Мы свяжем вас с дизайнером, который сможет внести изменения и отправить вам изображение в выбранном вами формате.

Примеры

• Изменить текст
• Изменить цвета
• Изменить размер до новых размеров
• Включить логотип или символ
• Добавьте свою компанию или название компании

файлов включены

Загрузка деталей…

• Идентификатор изображения

  29377921

• Цветовой режим

  RGB

• Художник

  бард777

Gate.io Review 2022 – Forbes Advisor

Примечание редактора: Мы получаем комиссию за партнерские ссылки на Forbes Advisor. Комиссии не влияют на мнения или оценки наших редакторов.

Наш вердикт

Gate.io поддерживает практически самый большой выбор криптоактивов среди всех криптовалютных бирж, в настоящее время более 1200 монет. К сожалению, из-за недавних изменений в нормативно-правовой среде в США Gate.io больше не предоставляет никаких услуг пользователям в США и Канаде .

Pros

• Огромный выбор доступных криптовалют, хотя некоторые из них могут быть недоступны в зависимости от местоположения
• Скидки и привилегии для держателей GateToken, собственной криптовалюты платформы

Минусы

• Для жителей США и Канады услуги не предоставляются
• Потенциально подавляющим для новых инвесторов
• Подлежит взлому в 2019 году

Содержание

• Кто должен использовать Gate.io?
• Сборы Gate.io
• Особенности Gate.io
• Криптовалюты на Gate.io

Показать больше

Кто должен использовать Gate.

io?

Неопытные инвесторы или те, кто только начинает, скорее всего, будут ошеломлены Gate.io, и они, вероятно, будут разочарованы невозможностью внести фиатную валюту, например доллары США, для покупки криптовалюты непосредственно на платформе. Если у вас еще нет монет, вам нужно будет использовать другую биржу, чтобы купить криптовалюту, а затем перевести ее на платформу, прежде чем вы сможете начать торговать.

Недавно Gate.io представила возможность покупать криптовалюту через сторонних партнеров, используя платежи по дебетовой или кредитной карте в фиатных валютах. Партнеры переводят вашу криптовалюту на счет Gate.io, но этот процесс требует невероятно высоких комиссий.

Криптоинвесторы и новички, которые предпочитают использовать фиатную валюту для покупки криптовалюты без посредников, лучше обслуживать такие платформы, как Binance.US и Coinbase, которые значительно упрощают и удешевляют процесс.

С другой стороны, изобилие торгуемых монет Gate.io и конкурентоспособные комиссии делают ее достойной платформой для продвинутых трейдеров, которые хотят гоняться за менее известными монетами на централизованной бирже и не возражают против того, что они будут ограничиваться спотовой торговлей. Это означает отсутствие маржи, фьючерсов, опционов, крипто-кредитования или ставок, и важно отметить, что некоторые монеты могут быть недоступны в определенных местах в зависимости от того, внес ли их Gate.io в белый список для этой области.

Тем не менее, даже трейдеры, которые соответствуют этим ограниченным параметрам, захотят убедиться, что они могут успешно пройти требования Gate.io «Знай своего клиента» (KYC), прежде чем вносить какую-либо свою криптовалюту. Процесс KYC, стандарт для большей части индустрии криптообмена, направлен на снижение риска использования средств в незаконных целях или в целях отмывания денег путем подтверждения пользователями своей личности. Вы должны пройти KYC Gate.io, прежде чем сможете вывести что-либо со своей учетной записи.

Помните, что криптовалюта — это чрезвычайно нестабильный класс активов, цены на который могут сильно колебаться. Криптобиржи не защищены от взлома. В 2019 году Gate.io подвергся громкому взлому, в результате которого было потеряно более 200 000 долларов криптоактивов, хотя примерно половина из них была позже восстановлена.

---

Комиссии Gate.io

Комиссии Gate.io за спотовую торговлю используют модель мейкера-тейкера. Пользователи платят различные комиссии в зависимости от того, забирает ли ордер ликвидность у биржи — в этом случае с них взимается комиссия тейкера — или добавляет больше ликвидности бирже — когда с них взимается комиссия мейкера. У вас нет возможности узнать заранее, будет ли ваш заказ мейкером или тейкером.

Вы имеете право на скидку в зависимости от того, сколько у вас есть GateToken (GT), родного крипто-токена Gate.io, или сколько GT у вас есть и сколько вы торгуете. Вы можете дополнительно снизить комиссию, решив оплачивать свои сделки с помощью GT.

1,5 BTC + 0 GT	0 ГТ	0,2% / 0,15%	0,2% / 0,15%
1,5 BTC + 20 GT	100 GT	0,185% / 0,139%	0,195% / 0,146%
3 BTC + 50 GT	300 GT	0,175% / 0,131%	0,185% / 0,139%
6 BTC + 200 GT	1000 GT	0,165% / 0,124%	0,175% / 0,131%
12,5 BTC + 500 GT	2500 GT	0,155% / 0,116%	0,165% / 0,124%

Чтобы получить полную скидку на объем/токены, посетите страницу комиссий Gate. io.

Как и в большинстве криптовалютных бирж, при снятии средств взимается комиссия, размер которой зависит от того, какую криптовалюту вы хотите вывести. Большинство из них представляют собой фиксированные ставки, которые могут быть крутыми при снятии небольших сумм, но становятся пропорционально меньше при снятии крупных сумм.

---

Особенности Gate.io

GateToken (GT)

Собственный токен Gate.io, GateToken (GT), дает пользователям право на торговые скидки в зависимости от их владения им и от того, используют ли они его для оплаты торговых комиссий. Это также может предоставить вам доступ к специальным действиям, таким как первоначальный запуск монет.

Безопасность

Несмотря на взлом Gate.io в 2019 году, рейтинг криптовалютных бирж (CER), третья сторона, которая оценивает кибербезопасность криптобиржи, назвал платформу лучшей биржей с точки зрения кибербезопасности в августе 2020 года, хотя с тех пор ее рейтинг упал. в некотором роде.

Протоколы безопасности включают двухфакторную аутентификацию с помощью SMS и электронной почты, а также требование, чтобы пользователи создавали отдельный пароль для снятия средств со своих счетов. Gate.io также запустила вознаграждение за обнаружение ошибок, которое вознаграждает тех, кто сообщает об ошибках и уязвимостях, чтобы обеспечить дополнительную безопасность на платформе. И, как сейчас принято среди крупных криптобирж, Gate.io хранит некоторые клиентские активы в холодном хранилище, отключенном от Интернета, чтобы снизить риск взлома.

---

Криптовалюты на Gate.io

Gate.io поддерживает более 1200 криптовалют, а это означает, что вы сможете найти практически любую интересующую вас монету на этой платформе. Лучшие монеты включают:

• Биткойн (BTC)
• Эфириум (ETH)
• Догикоин (DOGE)
• Монета Binance (BNB)
• Терра (ЛУНА)
• Горошек (DOT)
• Кардано (АДА)
• Лайткоин (LTC)
• ЭОС (ЭОС)

Щелкните здесь, чтобы просмотреть полный список доступных криптовалют Gate. io. Имейте в виду, что, хотя Gate.io предлагает огромный выбор монет, покупка менее известных монет с меньшими объемами торгов может привести к потере вложенных денег или невозможности перепродать свою монету быстро или с прибылью.

Помощь в принятии разумных финансовых решений

Получайте информационный бюллетень Forbes Advisor с полезными советами, новостями, обзорами продуктов и предложениями от имени, которому вы можете доверять.

Информация, представленная на Forbes Advisor, предназначена только для образовательных целей. Ваше финансовое положение уникально, и продукты и услуги, которые мы рассматриваем, могут не подходить для ваших обстоятельств. Мы не предлагаем финансовые советы, консультационные или брокерские услуги, а также не рекомендуем и не советуем отдельным лицам покупать или продавать определенные акции или ценные бумаги. Информация о производительности могла измениться с момента публикации. Прошлые показатели не свидетельствуют о будущих результатах.

Forbes Advisor придерживается строгих стандартов редакционной честности. Насколько нам известно, весь контент является точным на дату публикации, хотя содержащиеся здесь предложения могут быть недоступны. Высказанные мнения принадлежат только автору и не были предоставлены, одобрены или иным образом одобрены нашими партнерами.

Эта статья была полезной?

Оцените эту статью

★ ★ ★ ★ ★

Пожалуйста, оцените статью

Пожалуйста, введите действительный адрес электронной почты

Комментарии

Мы будем рады услышать от вас, пожалуйста, оставьте свой комментарий.

Неверный адрес электронной почты

Спасибо за отзыв!

Что-то пошло не так. Пожалуйста, попробуйте позже.

Еще от

Редакция Forbes Advisor независима и объективна. Чтобы поддержать нашу отчетную работу и продолжать предоставлять этот контент бесплатно нашим читателям, мы получаем компенсацию от компаний, размещающих рекламу на сайте Forbes Advisor. Эта компенсация происходит из двух основных источников. Сначала мы предоставляем рекламодателям платные места для представления своих предложений. Компенсация, которую мы получаем за эти места размещения, влияет на то, как и где предложения рекламодателей появляются на сайте. Этот сайт не включает все компании или продукты, доступные на рынке. Во-вторых, мы также размещаем ссылки на предложения рекламодателей в некоторых наших статьях; эти «партнерские ссылки» могут приносить доход нашему сайту, когда вы нажимаете на них. Вознаграждение, которое мы получаем от рекламодателей, не влияет на рекомендации или советы, которые наша редакционная команда дает в наших статьях, или иным образом влияет на какой-либо редакционный контент в Forbes Advisor. Несмотря на то, что мы прилагаем все усилия, чтобы предоставить точную и актуальную информацию, которая, по нашему мнению, будет для вас актуальной, Forbes Advisor не гарантирует и не может гарантировать, что любая предоставленная информация является полной, и не делает никаких заявлений или гарантий в связи с ней, а также ее точностью или применимостью. . Вот список наших партнеров, которые предлагают продукты, на которые у нас есть партнерские ссылки.

Вы уверены, что хотите оставить свой выбор?

Университет Золотых Ворот — Профиль юридического факультета 2020

536 Миссион-стрит Сан-Франциско, Калифорния 94105 (415) 442-6630

Веб-сайт Приемная электронная почта Электронное приложение

Сравнение стран: обзор фактов

#1 в Заработная плата в государственном секторе

Закон GGU привязан к #1 с точки зрения средней начальной заработной платы среди выпускников, работающих на государственных должностях или судебных клерках на федеральном уровне или уровне штата (90 518 долларов США).

#9 в Присутствие студентов из числа меньшинств

Звания закона GGU #9 с точки зрения самого высокого процента студентов, принадлежащих к расовым или этническим меньшинствам (65,5%).

#13 в Наличие женского факультета

Закон GGU привязан к #13 с точки зрения самого высокого процента преподавателей, которые составляют женщины (50,8%).

№ 24 в Присутствие факультета меньшинств

Закон GGU занимает # 24 с точки зрения самого высокого процента преподавателей, которые составляют расовое или этническое меньшинство (20,5%).

№ 59 в Соотношение студентов и преподавателей

Закон GGU привязан к № 59 с точки зрения самого низкого соотношения студентов и преподавателей (6,2: 1).

#63 в Зарплата в частном секторе

Закон GGU привязан к #63 с точки зрения средней начальной заработной платы выпускников, работающих в частной практике в качестве сотрудников юридической фирмы (82 000 долларов США).

#63 в Самая высокая плата за обучение

Звания закона GGU #63 с точки зрения самой высокой платы за обучение среди студентов-юристов дневного отделения (50 000 долларов США). Мы оцениваем в общей сложности 283 тарифов на обучение от 194 юридических школы, в два раза выше тех юридических школ, которые имеют разные цены за обучение в штате и за его пределами.

#125 в размер библиотеки

Звания закона GGU #125 с точки зрения размера библиотеки с 350 762 томами или эквивалентами.

#157 в Медиана LSAT

Закон GGU привязан к #157 с точки зрения среднего балла LSAT (150) среди тех абитуриентов, которые были зачислены на очную форму обучения. LSAT измеряет понимание прочитанного, аналитическое и логическое мышление.

№ 164 в Скорость принятия

Звания закона GGU #164 с точки зрения студенческой избирательности с процентом приема 61,3% среди тех, кто подал заявление о приеме.

#185 в Скорость прохода бара

Звания закона GGU #185 с точки зрения уровня прохождения бара среди начинающих тестируемых (47,6%), и он на -10,7% уступает общему уровню прохождения бара в штате Калифорния, составляющему 58,3%. (Национальное сравнение по этому показателю следует проводить с оговорками и с осторожностью, потому что в каждом штате разная скорость прохождения бара.)

#186 в Средний средний балл бакалавриата

Звания закона GGU #186 с точки зрения самого высокого среднего среднего балла бакалавриата (3,03) среди тех абитуриентов, которые поступили на очную форму обучения.

Об этом отчете

Этот отчет был выпущен весной 2019 г.

GPA и LSAT

Ссылки на самые низкие, средние и самые высокие баллы GPA и LSAT отражают баллы 25-го, 50-го и 75-го процентиля, соответственно, среди тех абитуриентов, получивших допуск, которые поступили на очную форму обучения осенью. 2018.

Показатели приема

Уровень приема соответствует количеству заявителей, получивших допуск в качестве студентов дневного отделения для занятий, начинающихся осенью. 2018. Уровень приема абитуриентов не отражает фактический уровень зачисления, это подмножество цифр.

Соотношение числа студентов и преподавателей

Соотношение студентов и преподавателей показывает количество студентов в этом классе на одного преподавателя. Это соотношение отражает допущенных к приему абитуриентов, которые поступили на очную форму обучения осенью. 2018.

Скорость прохода стержня

Показатели прохождения бара отражают показатели среди впервые сдавших тест зимой и летом. 2017 администрации адвокатских экзаменов. Отмечено государство, в котором наибольшее количество выпускников юридического факультета сдали экзамен на адвоката за отчетный период.

Уровень занятости

Показанные показатели занятости относятся к 2017 выпускники очной формы обучения на момент окончания учебы и через десять месяцев после окончания учебы.

Том 9 юридической библиотеки0177

В данных указывается количество томов печати и микроформ, а также их эквиваленты.

Пол, раса и этническая принадлежность

Приведенные данные показывают процентную долю преподавателей, состоящих из мужчин и женщин, соответственно, а также процентную долю преподавателей и студентов, принадлежащих к расовым или этническим меньшинствам. (латиноамериканцы любой расы, американские индейцы или коренные жители Аляски, азиаты, чернокожие или афроамериканцы, коренные жители Гавайев или других островов Тихого океана, представители разных рас, иностранцы-нерезиденты или представители неизвестной расы).

Заработная плата

Статистические данные о заработной плате относятся к выпускникам юридических факультетов, которые работают полный рабочий день и имеют длительный срок работы в классе 2017 на момент выпуска и в течение десяти месяцев после окончания (примерно весной 2018 ), по словам выпускников.

Заработная плата, указанная для «Средней частной зарплаты», отражает заработную плату 50-го процентиля среди тех выпускников, которые занимаются частной практикой в ​​качестве сотрудников юридической фирмы. Заработная плата, указанная для «Средней государственной заработной платы», отражает заработную плату 50-го процентиля среди тех выпускников, которые работают на государственных должностях или в судебных органах на федеральном уровне или уровне штата.

При определении средней заработной платы были исключены рабочие места, классифицируемые как «преимущество доктора права» (т. е. должности, на которых работодатель требует наличие степени доктора права или считает преимуществом наличие такой степени, но для которых не требуется допуск к коллегии адвокатов).

Название отчета

Обоснование того, что этот отчет называется «Отчет за 2020 год», заключается в том, что наша Рейтинг юридических вузов 2020 года отчет и Профили юридических школ 2020 года представляют значительный интерес для потенциальных абитуриентов юридических факультетов, которые хотят записаться на занятия, которые начнутся осенью 2020 года. На момент публикации этого отчета весной 2019 года, эти статистические данные о занятости отражают самые последние доступные данные.

Источник: данные были собраны из различных общедоступных источников, включая данные, опубликованные юридическими школами и офисами адвокатов в каждой юрисдикции.

Следующий выпуск: наш отчет за 2021 год планируется опубликовать весной 2020 года.

Об этом отчете

Этот отчет был выпущен весной 2019 г.

GPA и LSAT

Ссылки на самые низкие, средние и самые высокие баллы GPA и LSAT отражают баллы 25-го, 50-го и 75-го процентиля, соответственно, среди тех абитуриентов, получивших допуск, которые поступили на очную форму обучения осенью. 2018.

Показатели приема

Уровень приема соответствует количеству заявителей, получивших допуск в качестве студентов дневного отделения для занятий, начинающихся осенью. 2018. Уровень приема абитуриентов не отражает фактический уровень зачисления, это подмножество цифр.

Соотношение числа студентов и преподавателей

Соотношение студентов и преподавателей показывает количество студентов в этом классе на одного преподавателя. Это соотношение отражает допущенных к приему абитуриентов, которые поступили на очную форму обучения осенью. 2018.

Скорость прохода стержня

Показатели прохождения бара отражают показатели среди впервые сдавших тест зимой и летом. 2017 администрации адвокатских экзаменов. Отмечено государство, в котором наибольшее количество выпускников юридического факультета сдали экзамен на адвоката за отчетный период.

Уровень занятости

Показанные показатели занятости относятся к 2017 выпускники очной формы обучения на момент окончания учебы и через десять месяцев после окончания учебы.

Том 9 юридической библиотеки0177

В данных указывается количество томов печати и микроформ, а также их эквиваленты.

Пол, раса и этническая принадлежность

Приведенные данные показывают процентную долю преподавателей, состоящих из мужчин и женщин, соответственно, а также процентную долю преподавателей и студентов, принадлежащих к расовым или этническим меньшинствам. (латиноамериканцы любой расы, американские индейцы или коренные жители Аляски, азиаты, чернокожие или афроамериканцы, коренные жители Гавайев или других островов Тихого океана, представители разных рас, иностранцы-нерезиденты или представители неизвестной расы).

Заработная плата

Статистические данные о заработной плате относятся к выпускникам юридических факультетов, которые работают полный рабочий день и имеют длительный срок работы в классе 2017 на момент выпуска и в течение десяти месяцев после окончания (примерно весной 2018 ), по словам выпускников.

Заработная плата, указанная для «Средней частной зарплаты», отражает заработную плату 50-го процентиля среди тех выпускников, которые занимаются частной практикой в ​​качестве сотрудников юридической фирмы. Заработная плата, указанная для «Средней государственной заработной платы», отражает заработную плату 50-го процентиля среди тех выпускников, которые работают на государственных должностях или в судебных органах на федеральном уровне или уровне штата.